Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер
3 номер 4 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2004, № 3

Подписаться на 2018 год

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 3'2004

ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ IL-1b И IL-1RA НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕРАПИИ РЕКОМБИНАНТНЫМ IL-1b (БЕТАЛЕЙКИН) БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С

А.Ю. Громова, В.И. Кабанова, А.А. Казаков, А.В.Демьянов, Н.И. Кузнецов, А.С. Симбирцев

У 60 пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС) анализировали распределение аллельных вариантов генов семейства IL-1 и взаимосвязи между их присутствием и уровнями репликации вируса гепатита С в сыворотке крови больных, выраженностью цитолитического синдрома до и в течение 1,5 лет после системной терапии рекомбинантным IL-1b (6-8 нг/кг, 10 инъекций через день), уровнем лихорадки и индукцией экспрессии генов IL-1b и IL-1Ra в мононуклеарах периферической крови после первой инъекции этого препарата. Полиморфизм генов тестировали методами ПЦРи ПДРФ-ПЦР, экспрессию генов на уровне мРНК определяли методом ОТ-ПЦР. У больных присутствие гомозиготного полиморфного варианта гена IL-1b(-511) определялось в 5 раз чаще, чем у доноров (96 человек). Кроме того, в 3 раза чаще встречался гомозиготный высокопродуцирующий вариант гена IL-1b(+3953) и в 2 раза чаще - гомозиготный вариант гена IL-1a(-889). Наблюдалась тенденция к увеличению среди больных числа носителей варианта гена IL-1Ra*2 (VNTR). Носители гомозиготного высокопродуцирующего варианта гена IL-1b(+3953) наряду с относительно низкими показателями АЛТ до лечения, как правило, отвечали высокой и обязательной температурной реакцией (" 38 °C) на первое введение рекомбинантного IL-1b, сопровождающейся индукцией в мононуклеарах крови экспрессии эндогенного IL-1b. Однако эффективность терапии экзогенным IL-1b у таких лиц была незначительна. У больных с гомозиготным нормальным вариантом гена IL-1b, а также у носителей высокопродуцирующего варианта гена IL-1Ra*2 прослеживалась обратная тенденция: более высокие показатели цитолитического синдрома до лечения ассоциировались с низкими значениями лихорадки вплоть до ее отсутствия при введении пациентам рекомбинантного IL-1b; первое введение препарата вызывало у этих лиц снижение интенсивности экспрессии гена IL-1b и повышение экспрессии IL-1Ra. Терапия рекомбинантным IL-1b для носителей гомозиготного нормального варианта гена IL-1b и высокопродуцирующего варианта гена IL-1Ra*2 является высокоэффективной, так как позволяет значительно снизить показатели цитолитического синдрома и уровень репликации вируса гепатита С в сыворотке крови независимо от варианта генотипа вируса гепатита С. Согласно полученным результатам, генетический полиморфизм IL-1b и IL-1Ra может оказывать существенное влияние на характер протекания хронического гепатита С и восприимчивость больных к терапии рекомбинантным аналогом IL-1b. (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 3. С. 17-25.)

Ключевые слова: хронический гепатит С, рекомбинантный IL-1b, Беталейкин, генетический полиморфизм, лихорадка, АЛТ.

Результаты цитокиновой терапии оказались столь обнадеживающими, что это направление активно развивается в России и за рубежом. Однако опыт клинического применения рекомбинантных аналогов цитокинов показал, что действуют эти препараты выборочно. Многим пациентам такая терапия существенно помогает, у других терапевтический эффект выражен слабее или отсутствует, в ряде случаев наблюдаются выраженные побочные реакции. Среди исследователей и клиницистов все большую поддержку получает мнение о том, что терапия должна быть индивидуальной. Поиск факторов, определяющих индивидуальную чувствительность к цитокиновой терапии, позволит применять ее более обоснованно и результативно.

Рекомбинантный интерлейкин 1b (IL-1b) под коммерческим названием Беталейкин (БЛ) разрешен МЗ РФ к клиническому применению. Биологические свойства этого медиатора, такие как стимуляция костномозгового кроветворения, перестройка иммунопоэза, активация метаболизма соединительной ткани, усиление пролиферации фибробластов и эпителиальных клеток (ранозаживляющее действие), в настоящее время с успехом используются в клинической практике для лечения онкологических, инфекционных, хирургических, ЛОР и др. заболеваний [5]. Комплексным клинико-лабораторным исследованием установлен высокий лечебный эффект препарата БЛ у больных хроническим вирусным гепатитом С (ХГС) [2-4]. Однако эффективность лечения и степень выраженности побочных реакций при системном введении этого препарата, в частности лихорадки, у отдельных больных существенно различаются. Причины индивидуальной восприимчивости определяются рядом факторов. Одним из них может являться полиморфизм генов, кодирующих белки семейства IL-1, в частности, наличие в них небольших мутационных изменений - точечных замен нуклеотидов, тандемных повторов частей гена. Кластер генов IL-1 находится на хромосоме 2q13 и содержит гены IL-1a и IL-1b, рецептора IL-1 и рецепторного антагониста IL-1 (IL-1Ra), строение которых консервативно. Равновесие между продукцией, экспрессией и ингибицией синтеза белков этого семейства играет одну из ключевых ролей в развитии воспалительного процесса [5]. Установлена ассоциация носительства отдельных аллелей генов семейства IL-1 с рядом аутоиммунных, инфекционных и воспалительных заболеваний [11-13, 15, 19]. Выявлены аллельные ассоциации этих генов, ответственные за измененный характер экспрессии и продукции кодируемых белков, характер протекания, исход воспалительных реакций и восприимчивость к ним. Относительно продукции IL-1Ra при ряде заболеваний существуют противоположные результаты: в нескольких более ранних источниках сообщается о сниженном или неизмененном уровне выработки этого белка у носителей IL-1Ra*2 (VNTR). Однако в большинстве литературных работ убедительно доказывается, что этот вариант гена ответствен за повышенную выработку IL-1Ra [7, 10, 12, 19]. Причем носительство варианта IL-1Ra*2 связано с повышенной активность гена IL-1Ra как в ходе воспаления, так и у здоровых лиц, а также с редуцированной продукцией IL-1a [7, 12]. В то же время моноциты лиц, гомо- и гетерозиготных по аллелю IL-1b(+3953), продуцируют, соответственно, в 4 и 2 раза большее количество IL-1b, чем моноциты лиц, гомозиготных по нормальному аллелю этого гена [13]. Таким образом, присутствие в геноме сочетаний IL-1b(+3953)+/IL-1Ra*2- и IL-1b(+3953)-/IL-1Ra*2+ может оказывать существенное влияние на соотношение экспрессии IL-1b и IL-1Ra. Введение в организм с терапевтической целью рекомбинантного IL-1b также может влиять на этот баланс и, как упоминалось выше, переносится больными индивидуально. Согласно данным литературы, введение в организм экзогенного IL-1b индуцирует увеличение продукции мононуклеарами периферической крови эндогенного IL-1b [8].

Определение взаимосвязей полиморфизма генов семейства IL-1 с балансом экспрессии и продукции соответствующих белков, температурной реакцией организма на введение рекомбинантного аналога IL-1b, дозой препарата, биохимическими, иммунологическими показателями и его клинической эффективностью позволит приблизиться к пониманию индивидуального характера воспалительного ответа. В данной работе анализировалась взаимосвязь присутствия у пациентов с ХГС аллельных вариантов генов семейства IL-1 с уровнями репликации вируса гепатита С в сыворотке крови, выраженностью цитолитического синдрома до и в течение 1,5 лет после терапии БЛ, уровнем лихорадки и индукцией экспрессии генов IL-1b и IL-1Ra в лимфоцитах периферической крови после первой инъекции препарата.

Материалы и методы

Курс лечения БЛ был проведен 60 пациентам с ХГС. В группу включали только больных с уровнем аланиновой трансаминазы (АЛТ), не более чем в 5 раз превышающим значения нормы. Контрольную группу составили 96 доноров. Препарат БЛ назначали в дозе 6-8 нг/кг в течение 20 дней (10 инъекций через день). Во время лечения у ряда больных отмечались ожидаемые умеренно выраженные побочные эффекты (головная боль, боль в суставах, повышение температуры тела), которые появлялись непосредственно после инъекции препарата и держались в течение 2-3 ч. Ни у одного из больных не наблюдалось осложнений, вызвавших отмену препарата. Температурную реакцию организма в ответ на первое введение БЛ, не превышающую 36,9 °С, классифицировали как нормальную, как субфебрильную - в интервале 37-37,9 °С, и как фебрильную - свыше 38 °С [1].

Материалом для молекулярно-генетического анализа полиморфизма генов семейства IL-1 служили образцы высокомолекулярной ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови больных и здоровых лиц с использованием реагента для выделения ДНК (TriReagent, "Sigma"). Варианты генов, несущие точечные замены нуклеотидов: IL-1a(-889) в промоторном регионе; IL-1b(-511) в промоторном регионе и IL-1b(+3953) в районе 5-го экзона, определяли методом ПДРФ-анализа продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием праймеров, синтезированных в НПФ "Литех", соответствующих параметров температурных циклов и ферментов рестрикции ("Sigma") (табл. 1). ПЦР-реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси с использованием TE-Taq-ДНК-полимеразы и соответствующего готового буфера ("Сибэнзим"). Продукты рестрикции разделяли электрофоретически в 2-3%-ном агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете. В качестве маркера размера фрагментов ДНК использовали набор маркеров молекулярного веса с шагом 100 п.о. ("Сибэнзим"). При отсутствии замены нуклеотидов детектировались два фрагмента, при мутации продукт амплификации оставался целым, у гетерозиготных индивидов определялись три фрагмента ДНК. Генотипирование IL-1Ra проводили в тех же условиях методом ПЦР: амплифицировали участок ДНК, содержащий тандемные повторы по 86 п.о. (VNTR) в районе интрона-2, аллельный тип определяли по длине получаемого продукта амплификации при электрофоретическом разделении. Нормальный, более часто встречающийся вариант гена IL-1Ra содержит четыре таких повтора, наиболее значимый из полиморфных вариантов, аллель IL-1Ra*2, - два повтора, остальные варианты этого гена встречаются крайне редко - суммарно менее, чем у 1 % популяции [19], и в данной работе не рассматривались. Для краткого обозначения аллелей были приняты следующие сокращения: нормальный, не несущий мутацию аллель обозначали цифрой 1, полиморфный - цифрой 2, ген, гомозиготный по нормальному варианту аллеля - "1/1", ген, гомозиготный по полиморфному варианту - "2/2", гетерозиготный ген - "1/2". Варианты "2" генов IL-1b (+3953) и IL-1Ra*2 в дальнейшем именуются как высокопродуцирующие, варианты "1" генов IL-1b и IL-1Ra -как низкопродуцирующие. "Провоспалительные" IL-1b(+3953)+/IL-1Ra*2-, "противовоспалительные" IL-1b(+3953)-/IL-1Ra*2+ и относительно "нейтральные" варианты генотипов обозначали, как указано в табл. 2.

Экспрессию генов IL-1b и IL-1Ra на уровне мРНК тестировали до начала терапии БЛ методом ОТ-ПЦР с конечной электрофоретической детекцией количества полученного амплификата. Образцы тотальной РНК выделяли из 3-5*106 лимфоцитов, полученных из крови больных, с использованием TRI-Reagent ("Sigma"). кДНК синтезировали в реакции обратной транскрипции при инкубации 1 мкг тотальной РНК в мкл реакционной смеси, содержащей 100 Е обратной транскриптазы M-MuLV, по 1 мМ каждого dNTP, готовый реакционный буфер ("Сибэнзим"), 10 Е ингибитора РНК-аз ("Fermentas") и 0,1 мкг гексануклеотидных праймеров ("Литех"). Инкубация продолжалась 1 ч (10 мин - при 94 °С, 45 мин - при 42 °С, 5 мин - при 95 °С). ПЦР с кДНК проводили в 10 мкл реакционной смеси в присутствии специфических праймеров: для IL-1b - 5'-CGATCACTGAACTGCACGCTCCG-3', 5'-GGTGAAGTCAGTTATATCCTGGCCG-3' (величина фрагмента 204 п.о.); для IL-1Rа - 5'-GGCCTCCGCAGTCACCTAATCACTCT-3', 5'-TACTACTCGTCCTCCTGGAAGTAGAA-3' (424 п.о.), фермента GAPDH 5'-CCTCTACTGGCGCTGCCAAGGCTGT-3', 5'-TCCGAGGCCTGCTTCACCACTTC-3' (176 п.о.), синтезированных в НПФ "Литех". Режим амплификации составлял 30 циклов (1 мин - 94 °С, 1 мин - 61 °С, 1 мин - 72 °С) с финальной инкубацией 10 мин при 72°С. Пластины с гелем помещали на стекло трансиллюминатора и фотографировали видеокамерой ("Литех"), полученные результаты обрабатывали с помощью пакета программ Gel Imager и Gel Analysis ("Литех"). В качестве позитивного контроля для каждой пробы определялась экспрессия фермента GAPDH, постоянно экспрессирующегося в клетке. Индекс экспрессии генов цитокинов на уровне мРНК рассчитывали для каждой пробы как соотношение интенсивности флуоресценции в геле полосы цитокина и GAPDH. Спонтанную и индуцированную продукцию IL-8 клетками крови больных определяли с помощью тест-системы ООО "Цитокин" (СПб.). Количественное ПЦР-определение РНК вируса гепатита С и его генотипов выполнено в городском диагностическом вирусологическом центре С.-Петербурга с помощью тест-систем Amplicor (Швейцария). Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием точного метода Фишера, критериев Манна - Уитни и Крускала - Уоллеса. Влияние на эффективность терапии БЛ оценивали при помощи регрессии Кокса, где в качестве события принималось достижение нулевого уровня репликации вируса гепатита С в сыворотке крови. Численные данные приведены в виде M + SE, медиан значений.

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление