Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2017 год
3 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2006, № 4

Подписаться на 2018 год

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 4'2006

ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ КЛИНИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ И БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ

М.А. Старикович, Ю.Я. Кит, М.Я. Хавунка, Т.И. Негрич, Р.С. Стойка

Сравнивали действие препаратов иммуноглобулинов (Ig) плазмы крови клинически здоровых доноров и больных легкой и тяжелой формами рассеянного склероза (РС) на жизнеспособность клеточных культур лейкемии человека (Jurkat, MT-4, Namalwa) и мыши (L1210). Установлено, что Ig здоровых доноров обладают значительной цитотоксической активностью (индекс цитотоксичности IC >= 50) по отношению ко всем типам исследуемых клеток. Препараты Ig больных РС оказывали разнонаправленное действие на лейкемические клетки в зависимости от типа этих клеток: они были цитотоксичными (IC > 30) по отношению к В-лимфоцитам (Namalwa, L1210) и в ряде случаев стимулировали пролиферацию Т-лимфоцитов (Jurkat, MT-4). Изучение механизма цитотоксической активности Ig c помощью гель-микроэлектрофореза ДНК индивидуальных клеток линии МТ-4 (DNA comet assay) показало, что исследуемые Ig вызывают деградацию ядерной ДНК, характерную для апоптоза. На основании полученных результатов о разнонаправленном влиянии аутологических антител больных РС на выживаемость лимфоцитов сделано предположение о индивидуальных различиях в механизмах патогенеза РС у отдельных больных. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 4. С. 26-31.)

Рассеянный склероз (РС) занимает важное место среди аутоиммунных заболеваний человека, что обусловлено быстрым прогрессированием этого заболевания и ранней инвалидностью больных. РС относят к демиелинизирующим заболеваниям, для которых характерно образование склеротических бляшек в головном или спинном мозге, что приводит к развитию неврологических изменений разной степени тяжести [3]. В ЦНС больных РС происходит разрушение белка миелина, и это вызывает демиелинизацию оболочек аксонов нервных клеток, что, в свою очередь, приводит к ухудшению проводимости нервного импульса [1, 3]. Основной патологический процесс у больных РС протекает в белом веществе головного и спинного мозга, причем развитие этого заболевания сопровождается деструктивными изменениями не только нервных клеток, но и поражением других тканей и органов, что приводит к системным изменениям в функционировании организма [5, 7].

В последнее время для лечения РС и других аутоиммунных заболеваний начали использовать очищенные препараты иммуноглобулинов (Ig) крови человека [3, 10, 12]. После инъекции этих препаратов наблюдается значительный клинический эффект, хотя механизмы их действия на иммунную систему еще недостаточно изучены. Не исключено, что препараты Ig влияют на выживаемость и рост аутореактивных иммунных клеток больных РС, и в их организме происходят изменения продукции Ig, избирательно действующих на клетки иммунной системы.

Целью работы было исследовать влияние фракций Ig, выделенных из плазмы крови здоровых людей и больных РС, на рост в культуре лейкемических В- и Т-лимфоцитов человека и мыши. Ig отдельных больных РС были также проверены на способность индуцировать апоптоз Т-клеток.

Материалы и методы

Были обследованы три группы: <К> - клинически здоровые (6 человек - 3 мужчин и 3 женщины в возрасте от 20 до 45 лет), <Л> - 6 больных (2 мужчин и 4 женщины в возрасте от 18 до 47 лет) с легкой степенью тяжести РС с ремиттирующе-рецидивирующим типом течения заболевания, и <Т> - 8 больных (3 мужчин и 5 женщин в возрасте от 20 до 50 лет) с тяжелой прогредиентной формой РС. Диагноз РС был поставлен в соответствии с критериями МакДональда (2004) [4]. Все больные состояли на учете в Центре рассеянного склероза при Львовском национальном медицинском университете им. Данилы Галицкого.

Выделение Ig осуществляли по описанной методике [2]. Венозную кровь забирали в присутствии гепарина (конечное разведение 1:100). Для получения плазмы кровь центрифугировали при 500 g в течение 30 мин и выделяли из плазмы препараты Ig 3-кратным переосаждением сульфатом аммония. Для этого к 0,5 мл плазмы крови добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и осаждали центрифугированием фракцию Ig при 2000 g в течение 10 мин. Осадок растворяли в 250 мкл дистиллированной воды, и осаждение сульфатом аммония повторяли еще два раза, после чего Ig диализовали против фосфатно-солевого буфера (10 мМ Na2HPO4/Na3PO4, 0,14 М NaCl) на протяжении 18 ч. Концентрацию белка в препаратах определяли по методу Лоури [14]. Белки анализировали электрофорезом в градиенте концентрации (6-17,5 %) полиакриламидного геля в присутствии 0,1%-ного додецилсульфата натрия [11]. К препаратам Ig добавляли глицерин (конечная концентрация 20 %) (Sigma, USA) и хранили при -20 °С.

В работе использовали клеточные линии, полученные из коллекции Института экспериментальной патологии, онкологии и радиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины (Киев, Украина). Линии МТ-4 и Jurkat - лейкемические Т-лимфоциты человека; линия Namalwa - В-лимфоциты человека (лимфома Бэркитта); линия L1210 - лейкемические В-лимфоциты мыши. Клетки культивировали во флаконах Карреля в питательной среде RPMI 1640 (Sigma, USA) в присутствии 10 % эмбриональной коровьей сыворотки (Sigma, USA), 50 мг/мл гентамицина (Sigma, USA) до получения субконфлюентного состояния. Для исследования брали клетки в количестве 1 x 106 в мл, которые высевали в 96-луночный пластиковый планшет. Каждое исследование повторяли трижды. После 2-часовой инкубации клеток в культуральную среду добавляли препараты Ig (конечная концентрация 0,7 мг/мл) на 24 ч. Клетки окрашивали 0,1%-ным водным раствором трипанового синего. Количество живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных) клеток подсчитывали в гемоцитометрической камере под световым микроскопом Биолам Р (ЛОМО, Санкт-Петербург). Индекс жизнеспособности (ИЖ) определяли по формуле:

ИЖ = O/C x 100, где О - количество живых клеток после влияния Ig, С - количество живых клеток в культуре.

Индукцию апоптоза клеток линии МТ-4 препаратами Ig выявляли с помощью гель-микроэлектрофореза индивидуальных клеток (кометный анализ). Для этого клетки МТ-4 инкубировали с разными препаратами Ig, а именно с теми, которые проявляли цитотоксическую активность, или с теми, которые стимулировали рост клеток при указанных выше условиях. Кометный анализ клеток проводили, как описано в работе V. Hurez et al. [10]. Гель агарозы с клетками после проведения электрофореза окрашивали 0,05%-ным бромистым этидием и фотографировали под флуоресцентным микроскопом МИК МЕД 12 (ЛОМО, Санкт-Петербург) при 200-кратном увеличении.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программы OriginPro 7.0. Достоверность показателей оценивали по t-критерию Стьюдента.

Ключевые слова: рассеянный склероз, иммуноглобулины, лимфоциты, цитотоксическая активность, апоптоз.

Если Вы хотите прочесть статью целиком, заказывайте компакт-диск,
на котором Вы найдете ВСЕ статьи ВСЕХ номеров журнала за 2005 и 2006 годы!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2018 Цитокины и Воспаление