Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2009, № 3

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 3'2009

Иммунологические механизмы обеспечения терапевтического эффекта гриппозных векторов, экспрессирующих ESAT-6 антиген, при экспериментальном туберкулезе у мышей

Н.В. Заболотных, M.A. Стукова, Т.И. Виноградова, А.Ю. Егоров, П.Г. Назаров

Изучали действие терапевтической вакцинации рекомбинантными гриппозными векторами, экспрессирующими микобактериальный антиген ESAT-6 (Flu/ESAT-6), на пролиферацию спленоцитов, продукцию спленоцитами IFNg и IL-2 и фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов у мышей, инфицированных M. tuberculosis Erdman. Генерализованная туберкулезная инфекция у контрольных мышей сопровождалась ингибированием Th1-иммунного ответа. Показано, что двукратная иммунизация зараженных мышей вакциной Flu/ESAT-6, в сочетании с терапией противотуберкулезными препаратами, приводит к активации пролиферативной активности спленоцитов, повышению спонтанной продукции IFNg и ESAT-6-индуцированной продукции IL-2. Установлен стимулирующий эффект Flu/ESAT-6 на поглотительную и переваривающую функции перитонеальных макрофагов. Выявлено иммуноадъювантное действие PR8/NS1-125 вектора, не экспрессирующего ESAT-6 антиген, по активации фагоцитоза макрофагов. Сделан вывод, что реализация лечебного эффекта Flu/ESAT-6 осуществляется за счет стимуляции Th1-звена иммунитета, а также за счет иммуноадъювантных свойств самого гриппозного вектора. (Цитокины и воспаление. 2009. Т. 8, № 3. С. 27-32.)

Ключевые слова: туберкулез, терапевтическая вакцинация, Flu/ESAT-6, интерферон гамма, фагоцитоз.

Один из способов иммунотерапии туберкулезной инфекции – терапевтическая вакцинация показывает отсутствие эффекта и нередко ухудшение течения туберкулеза как при применении вакцины БЦЖ, так и при попытках использования других типов вакцинных кандидатов в большинстве доклинических исследований [2]. Позитивный лечебный результат получен только при использовании ДНК-вакцины на основе белка теплового шока микобактерий - Hsp65 [9].

В последнее время одним из наиболее перспективных специфических антигенов при конструировании новых противотуберкулезных вакцин считается ранний секреторный антиген микобактерий ESAT-6 (Early Secreted Antigen Target, 6 кДа), играющий роль одного из ведущих пусковых факторов, ответственных за раннюю продукцию ключевого фактора протективного иммунитета - интерферона g (IFNg) CD8-лимфоцитами, которые имеют специфические эпитопы для ESAT-6 [4]. Однако использование белка ESAT-6 в виде субъединичных или ДНК-вакцин выявило его недостаточную иммуногенность и необходимость многократной вакцинации с использованием адъювантов для формирования защитного эффекта [3].

В нашей работе в качестве векторов, несущих микобактериальный антиген ESAT-6, использовались рекомбинантные штаммы вируса гриппа с модифицированным геном NS1, в котором сохранена нуклеотидная последовательность, кодирующая первые 125 аминокислот белка NS1 вируса гриппа, а также добавлена последовательность, кодирующая микобактериальный белок ESAT-6. За счет нарушения основной функции полноразмерного белка NSl как антагониста системы интерферона I типа полученные штаммы теряют способность к полноценной репликации в организме хозяина, что обеспечивает безопасность их использования в качестве вакцинных препаратов [13]. Введение подобных штаммов in vivo приводит к развитию выраженного антиген-специфического Т-клеточного ответа к ESAT-6 антигену на системном уровне и поляризации иммунного ответа в сторону Th1 [12], что чрезвычайно важно для благоприятного течения и инволюции инфекции, поскольку ключевая роль в протективном характере иммунного ответа при инфицировании M. tuberculosis общепризнанна именно за Th1-цитокином - IFNg. Профилактический и терапевтический эффекты Flu/ESAT-6 (гриппозного вектора, несущего микобактериальный антиген ESAT-6), при экспериментальном туберкулезе показаны нами ранее [1, 11].

Целью настоящей работы была оценка влияния терапевтической вакцинации гриппозными векторами, экспрессирующими микобактериальный антиген ESAT-6 (Flu/ESAT-6), на иммунный статус мышей при генерализованном туберкулезе.

Материалы и методы

Рекомбинантный вирус гриппа подтипа H3N2 получен путем генетической реассортации вируса Flu/ESAT-6 (H1N1) с вирусом A/Aichi/1/68 (H3N2) на клетках Vero в присутствии кроличьей антисыворотки к вирусу A/PR/8/34 (H1N1). Клетки Vero (American Type Culture Collection (ATCC)) трансфецированы плазмидой, экспрессирующей химерную РНК NS-гена вируса гриппа, совместно с набором плазмид pTriEx-PB1, pTriEx-PB2, pTriEx-PA и pTriEx-NP, экспрессирующих белки полимеразного комплекса вируса гриппа (по 1 мкг каждой плазмиды). Трансфекцию проводили путем электропорации (Nucleofection technique, Amaxa) в соответствии с инструкцией по использованию. 24 ч спустя трансфецированные клетки Vero были заражены хелперными вирусами гриппа A/PR/8/delNS (H1N1) или A/Sing/delNS87 (H2N2), которые содержали частично или полностью удаленный NS-ген и вследствие этого были чувствительны к действию интерферона. В качестве селективного препарата добавляли человеческий лейкоцитарный интерферон альфа (NIBSC 1st International Standard 1999; 3 ЕД/мл культуральной среды). Конечная популяция вирусов содержала рекомбинантный NS-ген со вставкой ESAT-6, что подтверждалось секвенированием продукта ОТ-ПЦР.

Лечебный эффект иммунизации Flu/ESAT-6 исследовали на 140 мышах-самцах линии C57Bl/6 на модели генерализованного туберкулеза, вызванного введением в хвостовую латеральную вену культуры M. tuberculosis Erdman в дозе 106 КОЕ/мышь. Мышей иммунизировали на фоне обнаружения при контрольных вскрытиях множественных субмилиарных очагов специфического воспаления (через 2 недели после заражения) интраназально без наркоза в дозе 106 БОЕ/животное двукратно с перерывом в 3 недели. Контролем вакцинации Flu/ESAT-6 являлась двукратная иммунизация мышей гриппозными векторами, не содержащими ESAT-6 (PR8/NS1-125). Этиотропную терапию (изониазид 10 мг/кг + рифампицин 10 мг/кг, контроль лечения) начинали со дня первой иммунизации Flu/ESAT-6.

Пролиферацию спленоцитов мышей оценивали на 2-й, 5-й, 8-й и 14-й неделе после заражения в реакции бласттрансформации при индукции клеток фитогемагглютинином (ФГА, Sigma; 5,0 мкг/мл) и рекомбинантным белком ESAT-6 (Fusion Antibodies Ltd, Northern Ireland; 5 мкг/мл) на жидкостном сцинтилляционном счетчике по количеству включенного 3Н-тимидина. Продукцию IFNg и IL-2 в супернатантах нестимулированных и индуцированных ФГА (5 мкг/мл) и ESAT-6 (5 мкг/мл) культур спленоцитов определяли на 8 неделе после инфицирования с использованием иммуноферментных тест-систем QuantikineTM (R&D Systems, Minneapolis) и расчитывали по калибровочной кривой зависимости оптической плотности от концентрации цитокина.

Фагоцитоз определяли на 8-й и 14-й неделе после заражения в культуре перитонеальных макрофагов (Мф, 1´106 клеток), полученных из лаважа брюшной полости мышей, на пластиковых одноразовых чашках Петри (d=40 mm) в отношении клеточной взвеси дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae (1´107 клеток), опсонизированных сывороткой мышей. Вычисляли: фагоцитарную активность Мф (ФА) - процент Мф, вовлеченных в фагоцитоз; фагоцитарное число (ФЧ) - среднее количество дрожжей, поглощенных одной фагоцитирующей клеткой; показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - количество дрожжей, переваренных макрофагами за 1,5 часа культивирования, и индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) - отношение ФЧ за 1 ч культивирования к ФЧ за 2,5 ч культивирования.

Статистическую обработку данных проводили с использованием параметрического теста Стьюдента и непараметрического критерия Вилкоксона – Манна – Уитни.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление