Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2009, № 3

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 3'2009

Сравнительное изучение иммунокорригирующего действия нейропептидных препаратов при острой экспериментальной цереброваскулярной патологии

А.Е. Кульчиков , О.С. Моложавая ,О.В. Скачкова , Л.В. Гарманчук ,

Исследование выполнено на 49 крысах лини Вистар, у которых воспроизводили экспериментальный инсульт. Спустя 5 ч после воспроизведения инсульта различным опытнымгруппам вводили плацебо, церебролизин (Ц) («Ebewe», Австрия) или кортексин (К) («Герофарм», Россия) в одинаковой дозировке (2,5 мл/кг массы тела животного, внутрибрюшинно, 1 раз в сутки, в течение 7 дней). Через 7 дней животных забивали и оценивали функциональную активность NK клеток селезенки, пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов и распределение клеток по фазам клеточного цикла, а также фагоцитарную активность макрофагов селезенки и перитонеального экссудата. Показано, что при инсульте происходит снижение функциональной активности макрофагов, НК-клеток и подавление пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов. Применение Ц способствует нормализации всех нарушенных показателей иммунитета, при этом К оказывает менее выраженное иммунокорректирующее действие и не влияет на показатели сниженной пролиферативной активности Т-лимфоцитов. Следовательно, в условиях инсульт-индуцированного иммунодефицита использование Ц приводит к восстановлению нарушенных показателей иммунитета, причем Ц оказывает более эффективное иммунокорректирующее действие, чем К. (Цитокины и воспаление. 2009. Т. 8, № 3. С. 38-43.)

Ключевые слова: экспериментальный инсульт, иммунодефицит, церебролизин, кортексин.

Несмотря на огромные успехи современной сосудистой неврологии в XX веке, проблемы, связанные с изучением различных способов эффективного лечения инфекционно-воспалительных осложнений инсульта, остаются крайне актуальными [3]. Это связано с высокой частотой развития данного вида осложнений, особенно у больных с тяжелым течением инсульта [3, 8]. Развитию инфекционно-воспалительных осложнений способствуют нарушение метаболизма, поражение центральной регуляции функции органов и систем, а также нарушения в системном и региональном иммунном ответе [3, 8, 10, 12]. Одним из известных механизмов развития инфекционных осложнений инсульта является его стрессогенное действие, которое приводит к снижению функциональной активности Т-лимфоцитов и подавлению механизмов противоинфекционной защиты [8]. С другой стороны, нарушение центральной регуляции вследствие инсульта способствует нарушению нейрональной регуляции иммунной системы, особенно если очаг расположен в структурах мезолимбической системы, которая участвует в регуляции иммунного ответа [3, 8, 10]. Еще одним механизмом развития нарушения иммунного ответа является образования антител к белкам нервной ткани [8]. Степень иммунных нарушений, во многом определяющая характер и исход инсульта, может быть частично откорректирована при назначении ряда базисных препаратов для лечения инсульта [3]. Однако, более выраженный и максимально безопасный эффект может быть достигнут в результате использовании традиционных препаратов для лечения инсульта, которые обладают, помимо нейротрофической активности, и иммунокорригирующим действием. К их числу относится пептидергический ноотроп с нейроиммунотрофическим действием церебролизин (Ц) («Ebewe», Австрия). По данным многочисленных исследований, Ц нормализует нарушенный иммунный ответ у пациентов с различными неврологическими заболеваниями, сопровождающимися развитием иммунодефицита [1, 4, 9-12, 18, 19]. В проведенных исследованиях показано, что применение Ц у больных с инсультом препятствует развитию инфекционных осложнений за счет нормализации нарушенного иммунитета, что особенно важно для выживаемости и ускоренного восстановления [10, 12]. К наиболее близкому аналогу Ц из группы ноотропных нейропептидных препаратов относится кортексин (К) («Герофарм», Россия), который используется для лечения различных неврологических заболеваний, в том числе, инсульта [7]. По результатам различных исследований, К оказывает нормализующее действие на иммунную систему при различных неврологических заболеваниях [5, 6, 7]. Значит, нейропептиды способны влиять на состояние иммунной системы, что указывает на взаимосвязь между нервной и иммунной системами [14]. Следовательно, целью данного исследования явилось сравнительное изучение иммунокорригирующего действия нейропептидных препаратов Ц и К при инсульт-индуцированном иммунодефиците в эксперименте на животных.

Материалы и методы

Этические аспекты. Все работы с животными проводились согласно Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [20].

Объект исследования. В эксперименте задействованы 49 крыс линии Вистар (самки, возраст 4 месяца, масса 200-220 г). Все исследования с животными проводились в осеннее время года.

Дизайн исследования. Перед началом эксперимента животные были разделены на шесть групп, каждая из которых состояла из 7 животных: контроль - интактные животные (группа 1); ложнооперированные животные (группа 2); животные с экспериментальным инсультом (ЭИ) (группа 3); животные с ЭИ+плацебо (группа 4); животные с ЭИ+Ц (группа 5); животные с ЭИ+К (группа 6). Крыс всех групп подвергали оперативному вмешательству с целью воспроизведения инсульта. Лекарственные вещества Ц, К, а также плацебо (в качестве плацебо выбран физиологический раствор) вводили через 5 ч после воспроизведения инсульта, затем 1 раз в сутки в течение 7 дней, после чего животных забивали под эфирным наркозом (стадия III2-3) и проводили исследования иммунного статуса.

Моделирование экспериментального инсульта. Для моделирования монополушарного ЭИ у крыс, наркотизированных диэтиловым эфиром (стадия III2-3), производили рассечение покровных тканей в лобной, теменной и затылочных областях, удаляли надкостницу с костей свода черепа, после чего проводили трепанацию черепа. В области правой внутренней капсулы (координаты: H=4,0 мм; L=3,0 мм; A=1,5 мм; от брегмы), по атласу Paxinos G. et al. [21], осуществляли деструкцию мозговой ткани и повреждение сосудов с помощью 5-6 вращательных движений мандрена-ножа, введенного через направляющую иглу-канюлю [13, 22], после чего операционную рану зашивали. За состоянием животных наблюдали в течение суток. Ложнооперированным животным под наркозом проводили наркотизацию, скальпирование и трепанацию черепа.

Введение препаратов. Физиологический раствор, Ц и К вводили внутрибрюшинно в дозе 2,5 мл на кг массы тела животного 1 раз в день ежедневно в течение 7 дней.

Морфологический контроль очага инсульта. Для проведения морфологического контроля субнеокортикального повреждения мозга из каждой группы выбирали по одному животному, у которого помимо проведения исследования иммунной системы, проводили гистологические исследования головного мозга. Контроль топологии очага внутримозговой гематомы производили по фронтальным срезам мозга. Мозг крыс фикстровали в 10%-ном растворе формалина, подвергали стандартной гистологической проводке, выполняли срезы на микротоме «Historange» (LKB) толщиной 6 мкм с шагом 200 мкм, после чего срезы окрашивали по методу Ниссля.

Оценка состояния иммунного статуса.

1. Функциональную активность натуральных киллерных клеток селезенки (НК-клетки) оценивали при помощи проточной цитометрии. В качестве клеток-мишеней использовали две линии опухолевых клеток: К-562 и ЛСК (крысиная лимфосаркома, адаптированная к условиям суспензионного культивирования), полученных из банка клеточных культур Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины [16]. Клетки-эффекторы (спленоциты) и клетки-мишени в соотношении 25:1 культивировали в среде RPMI (Sigma, USA), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, Sigma, USA) и 40 мкг/мл гентамицина («Дарница», Украина) в атмосфере 5 % СО2 в течение 6 ч. Выживаемость клеток-мишеней оценивали цитофлюориметрически по включению йодистого пропидия (PI) [22].

2. Процесс индуцированной пролиферации Т- и В-лимфоцитов селезенки определяли с помощью метода проточной цитометрии, для чего ткань селезенки измельчали в среде RPMI-1640 и фильтровали до получения однородной клеточной суспензии. Клетки в концентрации 5´106 /мл инкубировали при 37 °С и 5% СО2 в течение 3 суток в полной культуральной среде RPMI-1640 в присутствии митогенов. Состав полной культуральной среды: 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 200 мг/л глютамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 25 мМ 2-меркаптоэтанола. В качестве стимулятора Т-лимфоцитов использовали фитогемагглютинин (ФГА) в концентрации 30 мкг/мл. В качестве стимулятора В-лимфоцитов - липополисахарид E. coli (ЛПС) в концентрации 100 мкг/мл. По окончании культивирования спленоциты окрашивали флюорохромом PI. Для этого клетки в количестве 106 на пробу после отмывки в 5 мл забуференного физиологического раствора при 1000 об/мин в течение 10 мин ресуспендировали в 1 ммл гипотонического лизирующего буфера (0,1 % цитрата натрия, 0,1 % Tritоn X-100, 5 мкг/мл РІ, препараты компании Sigma, USA). После осторожного встряхивания клетки инкубировали при 22-25 °С в течение 30 мин в темноте. Определяли распределение клеток по фазам клеточного цикла. Подсчитывали индекс стимуляции (ИС) путем деления показателя количества клеток пролиферативного пула при сокультивировании со стимуляторами на количество клеток пролиферативного пула в контроле [2].

3. Показатели фагоцитарной активности макрофагов селезенки и макрофагов перитонеального экссудата определяли с помощью проточной цитометрии на основе количественной оценки поглощенных меченных флюорохромом бактерий. Оценку фагоцитарной активности клеток проводили, используя штамм St. aureus, меченный флюоресцеинаизотиоцианатом (ФИТЦ). Для этого 90 мкл St. аureus, меченного ФИТЦ, в концентрации 109/мл вносили в пробирки для проточной цитометрии, добавляли равный объем клеток, в концентрации 2´106/мл, предварительно освобожденных от эритроцитарной массы при помощи лизируюшего раствора 0,9% NH4Cl. В качестве контроля использовали клеточную суспензию в концентрации 2´106/мл без добавления St. аureus. Пробы инкубировали в течение 30 мин при 37 °С, после чего добавляли к каждому образцу по 2 мл охлажденного забуференного физиологического раствора и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 400 мкл 0,4%-ного раствора формалина. С помощью проточноцитометрического гейтирования определяли относительное количество фагоцитирующих клеток [15].

Все проточноцитометрические анализы проведены на приборе FACSсаlibur (Bеcton Dickinson, USA), оборудованном аргоновым лазером с длиной волны 488 нм, с использованием программы CellQuest для Macintosh для получения и анализа данных. Для измерения флюоресценции фикоэритрина и РІ использовали узкополосный фильтр 585/42 нм, флюоресценции ФИТЦ - 642/75 нм [17].

Статистическая обработка. Статистический анализ проводили с использованием программ Biostat и Statistica 6.0. Для оценки долевого состава клеток в основных фазах митотического цикла (G1/0, S, G2+M) гистограммы распределения обрабатывали при помощи специализированной математической программы Mod Fit LT 3.0 (BDIS, USA) для компьютеров Macintosh. Все значения даны в виде средних арифметических и стандартных отклонений: M±SD. Достоверность различий средних значений устанавливали с помощью t-критерия Стъюдента.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление