Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер
3 номер 4 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2010, № 2

Подписаться на 2018 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2010

Спонтанная и индуцированная реструктуризация хроматина ядер нейтрофильных гранулоцитов при остром деструктивном панкреатите в стадии гнойных осложнений

И.В. Нестерова, Н.В. Колесникова, А.А. Евглевский, Е.В. Фомичева, С.В. Ковалёва, Л.В. Ломтатидзе

Нейтрофильные гранулоциты (НГ) — уникальная мультипотентная популяция клеток иммунной системы. Приобретенные дисфункции НГ имеют критическое значение в патогенезе различных осложнений, влияют на течение и исход, в первую очередь, генерализованных гнойно-септических процессов. Проведенное нами ранее изучение топологических свойств ядерного хроматина НГ у пациентов с острым деструктивным панкреатитом (ОДП) в стадии гнойных осложнений методом поляризационной микроскопии с использованием тестирования оптического анизотропного эффекта выявило высокую активацию хроматина ядер НГ больных, которая проявилась значительным снижением величины анизотропного эффекта по сравнению с уровнем анизотропии у здоровых лиц. В настоящем исследовании проведено сравнительное изучение спонтанной и индуцированной активации хроматина на фоне его структурных изменений у пациентов с ОДП в стадии гнойных осложнений. Полученные результаты позволили выявить депрессию функциональной активности НГ у больных с ОДП, выразившуюся в снижении способности клеток к активации хроматина ядер в ответ на дополнительную индукцию in vitro. Таким образом, изучение состояния хроматина ядер НГ и оценка изменений его транскрипционной активности под влиянием индуцирующего стимула представляет новый подход к определению функциональной активности клеток и может быть перспективным в диагностическом аспекте. (Цитокины и воспаление. 2010. Т. 9, № 2. С. 13-17.)

Ключевые слова: нейтрофильные гранулоциты, ядро, хроматин, активация, анизотропия.

В свете современных представлений нейтрофильные гранулоциты (НГ) – уникальная мультипотентная популяция клеток иммунной системы, относящаяся к врожденному иммунитету, обладающая при этом другими очень важными функциональными возможностями, позволяющими активировать, регулировать адаптивный иммунитет и способствовать его полноценной реализации [9]. К сожалению, существует устаревшее широко распространенное, но неправильное мнение о том, что нейтрофильные гранулоциты — это короткоживущие конечно дифференцированные клетки с высоко конденсированным ядром и, следовательно, не способные к экспрессии генов в ответ на индукцию. Однако рядом авторов показано, что НГ способны к транскрипционно-зависимому синтезу протеина теплового шока [13], к экспрессии РНК-кодированных фагоцитарных рецепторов [17], к модулированию синтеза РНК в ответ на воздействие глюкокортикоидов или лектина [14]. НГ могут повышать экспрессию генов, вовлекаемых в реализацию их фагоцитарной функции, таких как гены, кодирующие gp91phox и p22 phox — два компонента фагоцитарного цитохрома В [24]. НГ не только могут отвечать на воздействие провоспалительных цитокинов (TNFa, G-CSF, IFNγ) дифференцировкой — экспрессией рецепторов, присущих АПК, например, CD83 [16], но и могут становиться участниками формирования «цитокиновой сети» посредством секреции провоспалительных (IL-1α, IL-1β, CSF, IFNγ, TNFa и т. д.) и противовоспалительных (IL-4, IL-10, рецепторный антогонист IL-1 и т. д.) цитокинов, регулируя при этом экспрессию генов [20, 21]. Стимуляция НГ бактериальным липополисахаридом (ЛПС) индуцирует в НГ синтез как про-, так и противовоспалительных цитокинов [22].

В то же время проведены исследования, демонстрирующие взаимосвязь между изменением структуры хроматина и генной регуляцией в иммунной системе [25]. Показано, что изменения структуры хроматина являются регуляторным механизмом, управляющим транскрипцией генов цитокинов [10, 19]. Существуют доказательства возникновения модификации гистонов и ремоделирования хроматина при бактериальной инфекции [15]. Вместе с тем, Zhang X., Kluger Y., Nakayama Y. et al. (2004) [29] изучили изменения генной экспрессии и структуры хроматина в активированных НГ. НГ стимулировали опсонизированной Escherichia coli и хемоаттрактантом — пептидом формил-мет-лей-фен. Результаты продемонстрировали изменения уровня транскриптов 148 транскрипционных факторов и хроматин-ремодулирующих генов и 95 регуляторов белкового синтеза. Было показано также, что сочетанная транскрипционная регуляция, включающая изменения структуры хроматина, может играть определенную роль в быстрых изменениях генной экспрессии, которые возникают в НГ [29]. В то же время глобальные изменения в генной экспрессии НГ, возникающие во время рецептор-медиированного фагоцитоза, могут влиять на судьбу клеток, позитивно или негативно регулируя процессы апоптоза, а, следовательно, влиять на интенсивность и исход бактериального воспаления [18]. Показано, что основную роль в изменении топологического состояния ДНК играют ферменты-топоизомеразы. Исследования топоизомераз выявили большое разнообразие этих ферментов в про- и эукариотических клетках. Была установлена биологическая функция ферментов разных типов, а также аналогии и различия в их структурах и механизмах действия. Анализ топоизомераз с помощью различных методов (включая стационарную и быструю кинетику, сайт-направленный мутагенез и т. д.) позволил установить роль отдельных аминокислот как непосредственно в катализе реакций, так и в кооперативных взаимодействиях между различными доменами [26, 12, 27].

Существующие в настоящее время современные методы исследования экспрессии генов и изменений структурной упорядоченности хроматина являются достаточно сложными, требуют дорогостоящего оборудования и, к сожалению, малодоступны для широкого применения в клинике. В то же время существует метод поляризационной микроскопии, использующий оптический анизотропный эффект для изучения топологических свойств ядерного хроматина. Он позволяет эффективно выявлять структурные характеристики ядерного материала на разных этапах функционирования клетки [3, 5, 8]. Величина выявляемой анизотропии ядра отражает структурно-молекулярную упорядоченность хроматина, который является основным носителем генетической информации в клетке. Снижение уровня анизотропии может интерпретироваться как показатель, свидетельствующий о явлениях деспирализации хроматина, сопровождающихся ослаблением химических связей комплекса ДНК–гистон в ядрах клеток. Подобные явления указывают на биологическую активацию хроматина, что является предпосылкой для появления матричной активности ДНК с последующей экспрессией более нескольких сотен генов и дальнейшим белковым синтезом. Впервые этот высокочувствительный и доступный метод был использован нами для изучения активации ядер НГ здоровых лиц в норме и в условиях дополнительной стимуляции клеток агентами бактериальной природы (стафилококковым энтеротоксином А, культурой Staphylococcus aureus), а также у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБ ДПК) в процессе хирургического лечения. Было установлено, что воздействие бактериального антигена приводит к изменению структурной упорядоченности — активации ядерного хроматина НГ пропорционально интенсивности воздействия. В то же время у больных, страдающих ЯБ ДПК, по сравнению со здоровыми субъектами, наблюдалась активация ядерного хроматина НГ, уровень которой возрастал на фоне операционного стресса [5]. Вместе с тем, наши исследования по изучению фенотипической характеристики НГ, их фагоцитарной и микробицидной активности, поведения в нагрузочных тестах in vitro при гнойных (в т. ч. при остром деструктивном панкреатите (ОДП) в стадии гнойных осложнений), инфекционно-воспалительных (Hp-ассоциированном хроническом гастрите, ВЭБ-ассоциированных полипах желудка и т. д.), аутоиммунных и неопластических заболеваниях органов пищеварения продемонстрировали мультивариантность дефектов функционирования НГ, что оказывало негативное влияние на характер течения и исход различных по своей природе патологических процессов [8, 9]. При этом наиболее сложный вариант дефектности функционирования НГ имел место при ОДП. Это наблюдение, по-видимому, связано с тем, что развитие острого панкреатита сопровождается на первом этапе системной гиперактивацией НГ, которые инфильтрируют ткань поджелудочной железы, где, высвобождая большие количества биооксидантов, нитроксидов и гидролитических ферментов, способствуют локальной деструкции ткани и усугублению патологического процесса [6, 9]. «Бурная» системная воспалительная реакция, обусловлена «цитокиновым штормом» за счет гиперпродукции провоспалительных цитокинов, что способствует гиперактивации НГ. В ответ развивается компенсаторная противовоспалительная реакция, в основе которой лежит продукция противовоспалительных цитокинов, что не только сдерживает активность воспалительного процесса, но и, зачастую, обусловливает формирование глубокой иммунодепрессии, способствующей угнетению функций НГ. Приобретенные дисфункции НГ имеют критическое значение в патогенезе различных осложнений, влияют на течение и исход, в первую очередь, генерализованных гнойно-септических процессов [1, 2, 23]. В связи с изложенным особый интерес представляло изучение топологических свойств ядер НГ периферической крови у пациентов с ОДП в стадии гнойных осложнений, которое выявило высокую активацию хроматина ядер НГ, проявившуюся в значительном снижении величины анизотропного эффекта по сравнению с уровнем анизотропии у здоровых лиц [8]. В то же время исследования индуцированных изменений структуры хроматина ядер НГ при данной патологии ранее не проводились, хотя, с нашей точки зрения, проведение подобных исследований, безусловно, представляет определенный интерес.

Целью данного исследования явилось сравнительное изучение спонтанной и индуцированной активации хроматина ядер НГ, на фоне его структурных изменений, у пациентов с ОДП в стадии гнойных осложнений.

Материалы и методы

Объектом исследования была венозная кровь 18 условно здоровых лиц обоего пола в возрасте от 21 года до 55 лет и 28 пациентов с ОДП в фазе развития гнойных осложнений. Анизотропный эффект ядер НГ определяли в препарате–капле нейтрофильной взвеси. НГ выделяли из периферической крови, стабилизированной ЭДТА (2,7 %), с помощью центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколла–верографина (1,077:1,093 г/см3). Мазки фиксировали смесью этанола и ацетона (1:1, 20 минут), проводили гидролиз (5 н HCl, при 200 ºС, 30 минут), блокировали альдегидные группы раствором гидроксиламина по Р. Лили [4] при 37 ºС, 3 часа). Мазки окрашивали толуидиновым синим (Merck, Germany) в концентрации 0,05 % на 0,001 М цитратном буфере (рН=5,0, 20 минут) и исследовали с помощью поляризационного микроскопа «МП-8» (объектив ПЛАН-АПО-МИ 100´1,25; окуляр К10´) [5]. Для учета уровня анизотропии хроматина ядер нейтрофильных гранулоцитов использовали модификацию хорошо известного полуколичественного метода Астальди и Верга, адаптированного для изучения ядер [3, 11]. Все ядра разделяли по степени анизотропии на 4 группы, каждой из которых была присвоена определенная величина анизотропии от 0 до 3 (рис. 1).

В дальнейшем расчет анизотропии проводили по известной формуле:

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление