Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2010, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2010

Действие комплексов природных антимикробных пептидов и наночастиц серебра на микроорганизмы

Д.С. Орлов, О.В. Шамова, О.Ю. Голубева, Т.Ю. Пазина, Е.В. Ямщикова, Н.И. Колодкин, В.Н. Кокряков, Е.А. Корнева

Антибиотические пептиды системы врожденного иммунитета составляют основу противоинфекционной защиты организма человека и животных. В настоящее время изучаются возможности их практического применения и создания антимикробных средств с оптимальными свойствами. В работе были изучены антимикробные свойства комплексов природного антибиотического пептида бактенецина 3.4 и наночастиц серебра. Конъюгирование бактенецина 3.4 и наночастиц серебра приводит к образованию соединений, имеющих высокую антимикробную активность, в том числе в отношении штаммов бактерий, устойчивых к применяемым в медицине антибиотикам. Установлено, что антимикробное действие комплексов связано с их способностью подавлять метаболические процессы в бактериальных клетках. Комплексы наночастиц серебра с антимикробными пептидами не обладают выраженным мембранолитическим действием, свойственным пептидам. Поскольку разрушение мембран является основой токсического действия пептидов, ограничивающего их практическое применение, конъюгирование с наночастицами может рассматриваться как один из способов получения антибиотиков с оптимальными свойствами. Биологическая активность конъюгатов антимикробных пептидов и наносеребра нуждается в дальнейшем изучении. (Цитокины и воспаление. 2010. Т. 9, № 2. С. 32-36).

Ключевые слова: антибиотики, бактенецин 3.

Широкое применение в медицине антибиотиков вызвало, со временем, появление штаммов микроорганизмов, устойчивых к лекарственным препаратам. Задача преодоления резистентности возбудителей заболеваний к применяемым противоинфекционным препаратам - одна из наиболее актуальных в современной биомедицинской науке. Возможность преодоления резистентности связывают с разработкой антибиотиков следующего поколения на основе новых антимикробных веществ - натуральных и синтетических.

Среди антимикробных веществ естественного происхождения интенсивно изучаются в последние годы антибиотические пептиды (АП) человека и животных, являющиеся основными факторами противоинфекционной защиты системы врожденного иммунитета. АП обладают высокой антимикробной, противовирусной, противоопухолевой активностью. Антимикробное действие АП обусловлено, как правило, их быстрым мембранолитическим эффектом. Отличительной особенностью природных антимикробных пептидов является широкий спектр антимикробного действия. У большинства микроорганизмов резистентность к действию АП не возникает.

Основной трудностью в разработке новых антибиотических препаратов на основе АП является преодоление их цитотоксических свойств по отношению к клеткам человека.

In vivo одним из условий, препятствующих проявлению цитотоксической активности АП является то, что они функционируют кооперативно, в составе сложного ансамбля противомикробных веществ, при этом совместный защитный эффект достигается при минимальных концентрациях отдельных пептидов [5].

Среди новых синтетических материалов наночастицы металлов рассматриваются как перспективная основа для создания высокоэффективных антибиотиков. Пространственная структура и размер наночастиц обусловливают их уникальные свойства. Наночастицы металлов обладают разнообразными антибиотическими эффектами, механизмы которых изучаются. Обнаружено, что наночастицы серебра способны связываться с пептидогликанами бактериальных мембран, нарушать процессы деления микробных клеток, усиливать образование токсических свободных радикалов [6]. Важнейшей особенностью синтетических наночастиц является их устойчивость к ферментативному разрушению. Однако токсическое действие наночастиц серебра на животные клетки ограничивает возможности их использования [3].

Одним из путей в разработке лекарственных препаратов на основе новых природных и синтетических веществ является поиск способов их структурной модификации, приводящих к получению антибиотиков с оптимальными биологическими свойствами [11].

АП отличает высокое сродство к компонентам бактериальных мембран и способность встраиваться в липидный бислой, проникать во внутриклеточное пространство. Совмещение избирательности действия АП с устойчивостью наночастиц к метаболическому разрушению могло бы, по нашему мнению, привести к получению антибиотиков нового поколения.

С целью изучения возможностей направленного изменения свойств природных АП и наночастиц металлов нами синтезированы конъюгаты природного АП из лейкоцитов козы бактенецина 3.4 [10] и наночастиц серебра (НС-Бак3.4), изучены их антимикробные свойства.

Материалы и методы

Синтез наночастиц серебра и конъюгация антимикробного пептида бактенецина 3.4 с наночастицами. Наночастицы серебра синтезировали методом химического восстановления нитрата серебра с использованием цитрата натрия в качестве стабилизатора и борогидрида натрия в качестве восстановителя [4]. К водному раствору борогидрида натрия (6 мл, 10 мМ) добавляли 200 мл раствора нитрата серебра (25 мМ) и цитрата натрия (0,25 мМ). Реакцию проводили в течение 30 мин при интенсивном перемешивании. В результате получили гидрозоль, содержащий наночастицы серебра. Далее проводили конъюгацию наночастиц с химически синтезированным бактенецином 3.4 (Бак3.4), в N-конец молекулы которого была введена дополнительная аминокислота цистеин, содержащая сульфгидрильную группу, необходимую для связывания пептида с наночастицами [7]. Один мл золя наночастиц серебра добавляли к 250 мкл раствора Бак3.4 (2 мг/мл) в фосфатном буфере (140 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 8 мМ Na2HPO4, 1 мМ KH2PO4, pH 7,4). Через 24 ч конъюгаты отделяли от несвязавшегося пептида и других реагентов с помощью ультрацентрифугирования при 40000 g в течение 2 ч. Полученный осадок ресуспендировали в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 150 мМ NaCl, pH 7,4. Для оценки размеров частиц был использован метод рентгеновской дифракции, описанный ранее [1]. Полученные данные позволили заключить, что в изучаемой суспензии преобладают частицы диаметром 50 нм.

Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд.

Оценка антимикробной активности. Минимальные ингибирующие рост бактерий концентрации изучаемых соединений были определены методом серийных разведений этих веществ в питательной среде, содержащей микроорганизмы [12]. Антимикробную активность препаратов изучали в отношении ряда микроорганизмов: Escherichia coli (E. coli) ML-35р, MRSA ATCC 33591 (золотистый стафилококк, устойчивый к метициллину), Staphylococcus aureus 720A, Staphylococcus aureus SG511, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Pseudomonas aeruginosa - антибиотикорезистентный клинический изолят. В качестве питательной среды использовали бульон Мюллера - Хинтона. Суспензию микроорганизмов, находящихся в фазе логарифмичеcкого роста, вносили в лунки стерильного 96-луночного планшета (предварительно обработанного 0,1 % раствором бычьего сывороточного альбумина для снижения неспецифического связывания исследуемых веществ со стенками планшетов) – 1×104 КОЕ бактерий в 45 мкл среды на лунку. Двукратные серийные разведения исследуемых препаратов проводили в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, рН 7.4, с 150 мМ NaCl (НФБ) и вносили в лунки планшетов, содержащие суспензии микроорганизмов. В контрольные лунки вместо препаратов вносили НФБ; дополнительными контролями служили лунки, в которые вносили питательную среду, не содержащую микроорганизмы и НФБ. Планшеты инкубировали при 37 °С в течение 20 часов. За минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) принимали наименьшую концентрацию вещества, при использовании которой полностью ингибировался рост микроорганизмов в соответствующих лунках планшета.

Оценка проницаемости цитоплазматической мембраны бактерий. Принцип метода и штамм E. coli ML35p описан ранее [8]. О состоянии цитоплазматической мембраны E. coli ML35p судили по ее проницаемости для хромогенного маркера - о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (ONPG), являющегося субстратом для фермента β-галактозидазы, а также для продукта этой ферментативной реакции. Используемый в данном методе штамм E. coli ML35p отличается отсутствием пермеазы лактозы (фермента, осуществляющего транспорт лактозы в клетку), причем синтез β-галактозидазы в цитоплазме этой бактерии не индуцибельный, как у большинства бактерий, а конститутивный. При наличии в среде, окружающей бактерию, субстрата для β-галактозидазы ферментативная реакция с участием этого субстрата может происходить только в том случае, если он способен проникать через мембраны бактерии, то есть пока целостность мембран бактерий не нарушена, реакция не протекает. Если же под действием какого-либо повреждающего агента, например антимикробного пептида, цитоплазматическая (и также наружная) мембрана бактерии становится проницаемой для ONPG, хромогенный продукт его гидролиза внутриклеточным ферментом выходит в инкубационную среду. Оптическая плотность среды при длине волны 420 нм (максимум поглощения хромогенного продукта) увеличивается, что позволяет наблюдать за процессом повреждения внутренней мембраны бактерии под действием антимикробного агента в режиме реального времени. В эксперименте использовали ночную культуру E. coli ML35p. Суспензию бактерий центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин, осадок дважды промывали в НФБ. Концентрацию бактерий определяли, измеряя оптическую плотность суспензии при длине волны 620 нм и используя формулу: 1 ЕД. оптической плотности соответствует 2,5×108 КОЕ/мл. В работе использовали ONPG фирмы Sigma (США). Препараты исследуемых веществ растворяли в 0,01 % уксусной кислоте. Состав проб (100 мкл): 2,5 мМ ONPG; 2,5×107 КОЕ/мл бактерии; НФБ; 0,03% триптического гидролизата сои; исследуемое вещество в различных концентрациях. Контрольные пробы содержали вместо исследуемых препаратов равные объемы 0,01% раствора уксусной кислоты. Суспензию бактерий приготавливали непосредственно перед экспериментом и вносили в лунки 96-луночных планшетов, куда уже были добавлены изучаемые соединения и ONPG. Далее в планшетах проводили измерение оптической плотности раствора при длине волны 420 нм с помощью спектрофотометра SpectraMax 250 фирмы Molecular Devices при температуре 37 оС и периодическом встряхивании планшетов в течение 2 ч. Данные обрабатывали в программе Sigma Plot 9.

Оценка антибиотического действия препаратов с помощью маркера дыхательной активности бактерий - ресазурина описана ранее [9]. В присутствии размножающихся клеток, в которых активно протекают метаболические процессы, ресазурин восстанавливается, взаимодействуя с продуктами клеточной дыхательной цепи. Восстановленная форма, резоруфин - флюоресцентное вещество, детектируемое флюориметрически (поглощение - 575 нм, эмиссия - 590 нм). Размножение клеток сопровождается ростом флюоресценции, однако если рост культуры подавляется, то не наблюдается и увеличение интенсивности флюоресценции. Ночную культуру бактерии трижды отмывали в НФБ; полученную суспензию вносили в лунки черных планшетов, содержащие растворы исследуемых препаратов. Состав проб (конечный объем 100 мкл): 20 мкМ ресазурин; 2,5×107 КОЕ/мл бактерии; 0,04% триптический гидролизат сои; НФБ; исследуемые вещества в различных концентрациях. После добавления бактерий планшеты инкубировали при 37 °C и периодическом встряхивании; появление в инкубационной среде восстановленного продукта резоруфина детектировали, измеряя флуоресценцию проб в режиме реального времени на спектрофлюориметре Gemini EM, Molecular Devices (США).

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление