Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2011, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Врачу общей практики

Номер 1'2011

Влияние афобазола на функциональную активность моноцитов в системе in vitro

Ф.Г. Разумная, С.В. Сибиряк

В системе in vitro изучено влияние афобазола ((5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]) бензимидазола дигидрохлорида) (0,1 мкг/мл, 10 мкг/мл и 100 мкг/мл) на спонтанную и стимулированную ЛПС фагоцитарную активность моноцитов, генерацию активных форм кислорода (АФК), продукцию IL-1b и IFNa, а также влияние препарата на созревание дендритных клеток. В диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкг/мл афобазол значимо не изменял спонтанной фагоцитарной активности моноцитов, генерации АФК, продукции IL-1b, не обладал интерфероногенными свойствами (IFNa), но вызывал тенденцию к снижению отвечаемости моноцитов при стимуляции ЛПС. В высокой концентрации (100 мкг/мл) афобазол пропорционально повышал спонтанную и стимулированную фагоцитарную активность моноцитов, генерацию АФК и эмиссию IL-1b, но не IFNa. Присутствие в культуре 0,1 мкг/мл или 10 мкг/мл, но не 100 мкг/мл афобазола интенсифицировало созревание дендритных клеток моноцитарного происхождения. (Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10. № 1. С. 70–74.)

Ключевые слова: афобазол, моноциты, фагоцитоз, генерация активных форм кислорода, продукция цитокинов, созревание дендритных клеток.

Фармакологические препараты — производные бензимидазола характеризуются выраженной иммунотропной активностью. «Клеточными мишенями» действия бензимидазолов являются, в том числе, нейтрофилы и моноциты/макрофаги. Модуляция активности этих клеток может вносить существенный вклад в реализацию терапевтического действия и, нередко, в развитие побочных эффектов. Способность подавлять функциональную активность нейтрофилов и моноцитов (локомоторную активность, интенсивность «респираторного взрыва» при стимуляции, продукцию провоспалительных цитокинов и хемокинов, интенсивность фагоцитоза) продемонстрирована для бензимидазолов — ингибиторов «протонной помпы» (омепразола, ланзопразола, пантопразола) [6, 7, 14, 18]. Выраженное ингибиторное действие на активность моноцитов обнаружено у N-замещенных производных бензимидазола [9, 13, 17]. Напротив, производные бензимидазола, имеющие серу во 2-м положении азольного гетероцикла, к которым относятся актопротектор бемитил (бемактор), тиетанилбензимидазолы, тиазолобензимидазолы, некоторые бензимидазолы-антигельминтики стимулируют функции фагоцитов [1, 4, 5]. Структурно близок к этим соединениям и селективный анксиолитик и нейропротектор афобазол ((5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]) бензимидазола дигидрохлорид)) [2, 3], в числе показаний к применению которого указываются аутоиммунные и аллергические заболевания. Сведения о влиянии афобазола на функциональную активность моноцитов отсутствуют.

В настоящей работе представлены результаты анализа влияния афобазола (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]) бензимидазола дигидрохлорида) на функциональную активность моноцитов периферической крови здоровых доноров и на созревание дендритных клеток моноцитарного происхождения в системе in vitro.

Материалы и методы

Объектом исследования явились моноциты периферической крови 16 здоровых доноров (6 мужчин и 10 женщин в возрасте 28–30 лет). Все доноры были поставлены в известность о проводимом исследовании и дали согласие на участие в нем.

Мононуклеары выделяли путем градиентного центрифугирования (Histopague 1.077, Sigma). После двукратного отмывания средой RPMI-1640 (Sigma), клетки ресуспендировали в среде культивирования (глутамин-содержащая среда RPMI-1640, 10% FBS, 50 мкг/мл гентамицина сульфата) и помещали в лунки 48-луночных планшетов для культивирования (Costar). Концентрация клеток составляла 1,5–2×106 клеток/мл. После адгезии моноцитов в течение трех часов (37 °С, 5% CO2), неприлипшие клетки удаляли, сформированный монослой промывали, затем добавляли свежую среду культивирования. Клетки инкубировали 24 часа. В контрольные культуры вносили 200 нг/мл ЛПС E. coli BO:111 (Sigma) (стимулированные культуры) или эквивалентное по объему количество среды (нестимулированные культуры). В опытные культуры одновременно добавляли разведенную средой RPMI-1640 химически чистую субстанцию (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]) бензимидазола дигидрохлорида (афобазола) в конечных концентрациях 0,1 мкг/мл, 10 мкг/мл и 100 мкг/мл.

После 24-часовой инкубации монослой промывали теплой средой и проводили оценку фагоцитарной активности моноцитов и внутриклеточной генерации активных форм кислорода (АФК), используя спектрофотометрические методы [11, 16]. Для оценки фагоцитарной активности к клеткам добавляли теплую среду, содержащую карбокси-модифицированные флуоресцентные частицы латекса (зеленая флуоресценция) диаметром 1,5 мкм (Sigma), предварительно разведенные средой так, чтобы соотношение клетки:частица составило 1:20–1:25. После часовой инкубации (37 °С, 5% CO2) монослои помещали на лед, промывали холодным фосфатным буфером, затем добавляли лизирующий раствор (0,1% Triton X100 на фосфатном буфере, pH 7,2 — 7,3). Через 20 мин оценивали интенсивность флуоресценции лизатов (возбуждение 488 нм, эмисссия 525 нм) на люминесцентном спектрометре Perkin Elmer LS55 (USA). Для оценки продукции АФК после промывания к монослоям добавляли теплую среду, содержащую 10 мкМ 2′,7′-дихлорфлюоресцеина диацетата (DCF-DA) (Sigma) и инкубировали 30 мин (37 °С, 5% CO2). Затем среду удаляли, монослои промывали, добавляли лизирующий буфер и через 15 мин оценивали интенсивность флуоресценции при тех же длинах волн возбуждения и эмиссии. Результаты тестов выражали в условных единицах флуоресценции (RFU).

Для определения концентрации IFNa и IL-1b в супернататах культур использовали стандартный твердофазный иммуноферментный метод (ИФА) и коммерческие тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцово, Новосибирская обл.). Постановку метода осуществляли согласно рекомендациями фирмы-производителя. Результаты ИФА анализировали на планшетном фотометре Multiscan Plus (Labsystems). Расчет концентраций осуществляли в рамках программного обеспечения регистрирующего прибора.

Для оценки влияния афобазола на созревание дендритных клеток моноцитарного происхождения выполнено 4 эксперимента. Моноциты выделяли из взвеси мононуклеаров путем центрифугирования на ступенчатом градиенте перколла (Amersham) [12]. Клетки отмывали, ресуспендировали в среде IMDM (Sigma) c добавлением 10% FCS. Клетки инкубировали 3 сут в присутствии рекомбинантных препаратов цитокинов человека – rhIL-4 10 МЕ/мл (ImmunoTools) и rhGM-CSF 500 МЕ/мл (ImmunoTools), затем производили смену среды и инкубировали еще 3 суток в присутствии rhIL-4 10 20 МЕ/мл и rhGM-CSF 1000 МЕ/мл. Индукцию созревания незрелых дендритных клеток осуществляли путем 48-часовой инкубации незрелых дендритных клеток в присутствии коктейля, включающего rhGM-CSF 500 МЕ/мл, hrTNFα 25 нг/мл (ImmunoTools), hrIL-1b 50 нг/мл (ImmunoTools) и ЛПС E. coli BO:111 100 нг/мл (контрольные культуры), или в присутствии индукторов созревания и афобазола (опытные культуры). После инкубации определяли статус созревания путем оценки экспрессии кластеров дифференцировки CD86 (анти-hCD86-APC, BD), CD83(анти-hCD86-PE, BD), и HLA-DR (анти-hCD86-PerCP, BD) на проточном цитометре FACSCаnto (BD) (анализ данных, FCSExpress V3).

Статистическую обработку результатов проводили в рамках программного обеспечения Statistica для Windows (версия 6.0).

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление