Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2011, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2011

Определение локализации эцефалитогенных Т-клеток в курсе пассивного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита требует сочетанного использования проточной цитометрии и количественной ПЦР

М.А. Носов, Е.А. Корнева

Преклинический этап развития экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у крыс, индуцированного адоптивным переносом (апЭАЭ) активированных T-клеток, сенсибилизированных к основному белку миелина (TMBP-клеток), протекает бессимптомно и занимает 48–72 ч, начиная с момента введения TMBP-клеток. В конце преклинической фазы апЭАЭ наблюдается массовая миграция TMBP-лимфоцитов в ЦНС, что сопровождается первыми проявлениями клинических симптомов. Во время преклинического этапа апЭАЭ, вследствие взаимодействия с микроокружением в органах, в которых они находятся, формируется «миграционный фенотип» энцефалитогенных TMBP-клеток, позволяющий им проникать через гематоэнцефалический барьер и вызывать воспаление в ЦНС, которое ведет к нарушению проводимости аксонов и развитию параличей. Знание функциональных перестроек, происходящих с энцефалитогенными Т-клетками, и их локализации на преклиническом этапе апЭАЭ представляет определенный интерес для поиска факторов, участвующих в развитии этих процессов. Сравнение двух методов анализа распределения TMBP-клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок в качестве маркера, в различных органах с использованием проточной цитометрии и количественной ПЦР на основе геномной ДНК свидетельствует о том, что для получения корректной картины распределения Т-клеток необходимо использовать сочетание различных методов исследования. (Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10, №. 1. С. 27–31.)

Ключевые слова: экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, энцефалитогенные Т-клетки, количественная полимеразная цепная реакция, проточная цитометрия.

Благодаря методу ретровирусной трансдукции Т-клеток, специфичных к основному белку миелина (major basic protein, MBP) — TMBP-клеток, разработанному Александром Флюгелем, стало возможным экспрессировать ген зеленого флуоресцентного белка (GFP, green fluorescent protein) и проследить локализацию и функциональные изменения, которые происходят с TMBP-лимфоцитами на преклиническом этапе развития экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) [3]. Использование трансгенных линий энцефалитогенных (ЭГ) Т-клеток дает возможность определять локализацию и функциональные изменения именно популяции MBP-специфичных клеток, что было невозможно при использовании классических гистологических методов. Преклинический этап развития ЭАЭ, индуцированного адоптивным переносом Т-клеток (апЭАЭ), протекает бессимптомно и занимает 48–72 ч, начиная с момента введения активированных TMBP-клеток. Во время преклинического этапа апЭАЭ TMBP-клетки мигрируют, оставаясь на периферии (околотимические лимфатические узлы, селезенка, кровоток), и претерпевают существенные изменения, которые выражаются в ослаблении продукции поверхностных маркеров активации лимфоцитов, таких как CD25 и OX40. Параллельно с потерей маркеров активации происходит активация экспрессии рецепторов к хемокинам на поверхности TMBP-лимфоцитов. В конце преклинической фазы апЭАЭ наблюдается массовая миграция TMBP-лимфоцитов в ЦНС, что сопровождается первыми проявлениями клинических симптомов. Согласно предположению, во время преклинического этапа апЭАЭ, вследствие взаимодействия ЭГ клеток со средой органов, в которых они находятся, формируется «миграционный фенотип» ЭГ клеток, позволяющий им преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и вызывать воспаление в ЦНС, которое ведет к нарушению проводимости аксонов и развитию параличей [2]. Перепрограммирование Т-клеточного фенотипа на «миграционный» включает также активацию молекул клеточной адгезии, например, комплекса VLA-4/VCAM-1, который необходим для связывания Т-клеток с эндотелием сосудов мозга [1]. Детальное изучение миграции ЭГ клеток через стенки сосудов в белое вещество мозга стало возможным благодаря развитию флуоресцентной и мультифотонной микроскопии, позволяющей отслеживать миграцию и взаимодействие клеток прижизненно в реальном времени [8]. Наряду с молекулами клеточной адгезии в формировании «миграционного» фенотипа могут участвовать протеазы, например, металлопротеазы 9 и 14 [5, 6]. После проникновения в ЦНС аутореактивные Т-клетки начинают взаимодействовать с антиген-представляющими клетками мозга [2]. Подтверждение образования иммунного синапса между ЭГ клетками и антиген-представляющими клетками получено при использовании двухфотонной микроскопии [4]. В отличие от MBP-сенсибилизированных клеток, овальбумин-специфические Т-лимфоциты не образуют иммунных синапсов в ЦНС из-за отсутствия специфического антигена. Клинические симптомы ЭАЭ проявляются только в случае успешной реактивации Т-клеток в ЦНС. Будучи реактивированными в ЦНС, ЭГ лимфоциты вызывают волну массовой экспансии неспецифических клеток иммунной системы в ЦНС посредством синтеза провоспалительных цитокинов и хемокинов. Массовая миграция макрофагов и активация системы комплемента является причиной гибели олигодендроцитов и ведет к повреждению проводящей функции аксонов [7].

Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению патогенеза апЭАЭ, остается не до конца ясным, какие клеточные и экстраклеточные компоненты тканей, с которыми взаимодействуют ЭГ клетки в ходе миграции на преклиническом этапе, вовлечены в процессе формирования «миграционного фенотипа» и какие изменения, происходящие в ЭГ клетках, его определяют. По-видимому, Т-лимфоциты, сенсибилизированные к MBP, играют роль провокатора воспаления в ЦНС и поэтому наиболее важны на начальных стадиях развития ЭАЭ. Для того, чтобы определить локализацию ЭГ Т-клеток на преклинических этапах развития ЭАЭ и сравнить чувствительность различных методов, мы провели сравнительный анализ результатов, полученных при использовании проточной цитометрии и количественной ПЦР и обнаружили, что использование дублирующих методов исследования позволяет получить наиболее достоверную картину.

Материалы и методы

Для получения антиген-сенсибилизированных лимфоцитов и их генетической модификации применяли методы, описанные в работе A. Flugel [3]. Полученные линии ЭГ Т-клеток, экспрессирующих GFP (фенотип Th1), использовали для индукции апЭАЭ у крыс Lewis путем введения 5´106 клеток внутривенно. Для подсчета клеток методом проточной цитометрии производили забор органов на различных сроках после внутривенного (хвостовая вена) или внутрибрюшинного введения 5´106 активированных MBP Т-клеток. Органы помещали на лед и взвешивали. Для анализа забирали кровь, селезенку, а также спинной мозг. Гепаринизированную кровь в количестве 4 мл использовали для получения лимфоцитарной фракции на градиенте Optiprep (Sigma-Aldrich, Heidelberg, Germany), после чего клетки отмывали и подсчитывали. Селезенку гомогенизировали через металлический фильтр, после чего обрабатывали буфером ACK (0,15 M NH4Cl, 10 мМ KHCO3, 0,1 мМ Na2ЭДТА) для лизирования эритроцитов. Белые кровяные клетки отмывали и ресуспендировали в фосфатном буфере для дальнейшего подсчета. Спинной мозг гомогенизировали, и клетки помещали на градиент плотности Nycodenz (Axis-Shield, Heidelberg, Germany) для выделения лимфоцитов. Флуоресцентные гранулы добавляли в пробу для проточной цитометрии в определенном количестве, что позволяло затем определять общее количество ЭГ Т-клеток в образце. Цитометрию проводили на FACS Calibur (BD Bioscience). Распределение ЭГ Т-клеток с помощью количественной ПЦР определяли следующим образом. Исследуемые органы забирали у животных после эвтаназии на определенных сроках после введения клеток. Органы взвешивали и примерно 50 мг ткани гомогенизировали в буфере (10 мМ Tris HCl pH 8,5; 5 мМ ЭДТА; 0,4% ДСН; 200 мкг/мл протеиназы K) и инкубировали 12 ч при 50 °С. Геномную ДНК очищали методом фенол-хлороформовой экстракции с последующим осаждением изоамиловым спиртом. Количественную ПЦР проводили методом TaqMann ПЦР с использованием праймеров для детекции eGFP и Maxima™ Probe qPCR Master Mix (Fermentas, Germany). В качестве стандартной кривой использовали результаты количественной ПЦР с геномной ДНК, выделенной из соответствующих тканей интактного животного, с добавлением различных разведений Т-клеток, экспрессирующих GFP. В эксперименте использовали крыс инбредной линии Lewis, предоставленных виварием Института биохимии им. Макса-Планка (Martinsried, Germany). В эксперименте по детекции ЭГ Т-клеток с помощью проточной цитометрии в каждую группу входило по 6 животных. 3 животных входило в каждую экспериментальную группу в эксперименте по анализу распределения ЭГ Т-клеток количественной ПЦР. Статистическую обработку осуществляли с помощью программы Statistica 5 методом Манна — Уитни — Вилкоксона.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление