Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2011, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Врачу общей практики

Номер 2'2011

Эффекты индукторов интерферона на экспрессию генов-регуляторов апоптоза в лимфоцитах человека

Т.М. Соколова, Т.П. Оспельникова, Л.В. Колодяжная, А.Н. Шувалов,

Цель — выяснить действие индукторов IFN (препаратов кагоцел, поли(И):поли(Ц), ридостин, циклоферон) на транскрипцию генов-регуляторов апоптоза bcl-2 и fas-рецептора CD95 в лимфоцитах здорового человека (донора) и ребенка с онкологическим заболеванием (нейробластома). Дополнительно изучено влияние препаратов на экспрессию конститутивного гена белка цитоскелета — гамма-актина, продукцию IFNα, IFNγ и TNFα. Сравнительный анализ генной экспрессии выполнен полуколичественным методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Определены виды и уровни продуцируемых цитокинов методом ИФА, противовирусная активность IFN в культуре фибробластов человека. Показано, что исследованные препараты являются регуляторами генов клеточного апоптоза на уровне транскрипции, по-разному влияют на протоонкоген bcl-2 и ген fas в лимфоцитах. Показана способность препаратов дсРНК индуцировать в лимфоцитах здорового человека преимущественно IFNγ, а в лимфоцитах больного ребенка IFNα. Синтезируемые лимфоцитами больного ребенка интерфероны обладали выраженной противовирусной активностью. Препарат ридостин выделялся способностью индуцировать высокие уровни TNFα в лимфоцитах больного ребенка и, подобно циклоферону, активировать апоптозный ген Fas-рецептора. (Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10. № 2. С. 75–81.)

Ключевые слова: индукторы интерферона, Bcl-2, Fas-рецептор, лимфоциты человека.

Процессы регуляции активности клеточных генов, ответственных за апоптозные реакции и взаимодействия популяций лимфоцитов, являются основополагающими для иммунитета живых организмов и обеспечивают сохранение их гомеостаза. Ведущая роль в контроле рецепторного и митохондриального путей развития апоптоза принадлежит гену bcl-2 и гену fas рецептора CD95 [13]. Важную роль в развитии апоптоза выполняет цитоскелет клетки и гены, кодирующие его структурные белки. Актины являются мишенями протеолиза активированными эффекторными каспазами.

В настоящей работе исследованы индукторы интерферона (IFN) разной природы (дсРНК-ридостин и поли(И):поли(Ц), кагоцел и циклоферон), которые широко применяются для профилактики и лечения вирусных инфекций, при нарушениях интерферонового и иммунного статуса [1]. В литературе содержится обширная информация о механизмах проявления двуспиральными РНК (дсРНК) антивирусной активности c участием дсРНК-зависимых ферментов и значительно меньше сведений о влиянии индукторов IFN на гены клеточной пролиферации и апоптоза [7]. Изучение препаратов циклоферон и кагоцел (индукторы IFN) в этом направлении только начинается, несмотря на их успешное клиническое использование в последние годы [15].

Bcl-2 относится к ингибиторам митохондриального апоптоза [9]. В результате связывания Bcl-2 с группой проапоптозных BH-3 белков Bax, Bad, Bim и др. осуществляется контроль открытия мембранных каналов в митохондриях и освобождение цитохрома С в цитоплазму. Цитохром С участвует в формировании комплекса апоптосомы и активирует прокаспазу 3, что приводит к протеолитическому гидролизу ряда важных клеточных субстратов. Высокие уровни экспрессии гена bcl-2 защищают клетки от апоптоза, вызванного разными цитотоксическими воздействиями и вирусами.

Bcl-2 является мишенью для создания противоопухолевых лекарств [6]. Недавно было продемонстрировано, что действие ряда низкомолекулярных соединений, в том числе госсипола (входит в состав препарата кагоцел), направлено на связывание с Bcl-2 и вызывает апоптоз в клетках с высоким уровнем синтеза протоонкогена [17]. Предполагают, что действие госсипола затрагивает регуляцию Rb-белка и циклина D1 и влияет на регуляцию апоптоза [10].

Fas-рецептор (CD95) является членом семейства фактора некроза опухоли (TNF) и участвует в передаче сигналов индукции апоптоза с клеточной мембраны при различных стрессовых воздействиях [13]. Взаимодействие Fas-рецептора с лигандами обеспечивает цитотоксический иммунный ответ Т- и В-лимфоцитов и инициирует каскад процессов с участием прокаспазы 8 и универсального фактора транскрипции NFκB. Ингибитор Fas-рецептора FAIM (Fas apoptosis inhibitory molecule) обеспечивает резистентность В-лимфоцитов к апоптозу и усиливает в них экспрессию рецептора CD40 [11]. Среди индуцируемых апоптозных генов — гены Fas/CD95, TRAIL/APO2L, каспаз 4 и 8, DAP-киназ, IFN-регулируемых факторов транскрипции (IRF1, 3, 7, 8) и ферментов системы IFN: олигоаденилатсинтетазы, протеинкиназы, РНК-азы и др. [7].

Известно, что человеческие лимфоциты характеризуются высокими уровнями экспрессии рецепторов врожденного иммунитета TLR 1, 6, 7, 9 и 10 [8]. TLRs и связанный с ними универсальный фактор транскрипции NFκB играют важную роль в передаче сигналов на гены клеточной защиты и апоптоза [14]. ДсРНК способны активировать их экспрессию. Информация о действии препаратов кагоцел и циклоферон на клеточные гены очень ограниченная. В основном, изучалось влияние препаратов на синтез мРНК IFNα, фактора некроза опухолей (TNF) и группы интерлейкинов [2]. Данные получены качественным методом ОТ-ПЦР (обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция) и не позволяют количественно оценить уровни индукции активируемых генов. По нашим данным [3], инъекции циклоферона здоровому пациенту стимулировали в клетках крови экспрессию генов IFN типа 1, преимущественно генов фибробластного IFN. Дополнительно циклоферон активировал гены Fas-рецептора и дсРНК-зависимой протеинкиназы.

Все вышесказанное явилось основанием для более детального сравнительного изучения действия 4-х препаратов (поли(И):поли(Ц), ридостина, кагоцела и циклоферона) на экспрессию генов-регуляторов апоптоза bcl-2 и Fas-рецептора. Важно было оценить влияние препаратов на транскрипционную активность гена белка цитоскелета гамма-актина. Анализ уровней транскрипции мРНК этих генов выполнен полуколичественным методом ОТ-ПЦР в популяциях лимфоцитов здорового донора и ребенка с онкологическим заболеванием. Параллельно определена спонтанная и индуцируемая этими препаратами продукция IFNα, IFNγ и TNFα методами иммуноферментного анализа. Установлена противовирусная активность IFN, продуцируемых лимфоцитами больного ребенка.

Материалы и методы

Из периферической крови двух пациентов (взрослого донора и ребенка с нейробластомой) были выделены два пула лимфоцитов стандартной процедурой разделения клеток в градиенте плотности фиколла [5]. Клеточная суспензия была приготовлена в среде RPMI-1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и антибиотики.

Исследованы индукторы IFN: кагоцел, гетероцепной полимер карбоксиметилцеллюлозы, ковалентно связанный с полифенолом госсипола (таблетка 12 мг; «Ниармедик», НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи); дсРНК ридостин, полученную из лизатов киллерных дрожжей S. cerevisiae, содержание дсРНК 10 % (ампула 8 мг; НИКТИ БАВ Минмедмикробиопром); поли(И):поли(Ц) (10 мг, коммерческий препарат; «Serva», Германия); циклоферон , N-метилглюкаминовая соль акридонуксусной кислоты (12,5 % водный раствор; НТФФ «Полисан»). Все препараты разводили в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Конечные концентрации в питательной среде для культивирования лимфоцитов (RPMI-1640 с 10% ЭТС и антибиотиками) составили: кагоцела — 250 мкг/мл, ридостина-дсРНК — 100 мкг/мл, поли(И):поли(Ц) — 50 мкг/мл, циклоферона — 625 мкг/мл.

Препараты IFN и индукторов добавляли к 2 мл суспензии лимфоцитов (2 млн/мл) в питательной среде и инкубировали в пластиковых пробирках 24 ч при 37°С. После контакта клеток с препаратами оценивали жизнеспособность по окраске трипановым синим; погибших клеток обнаружено не было. Лимфоциты осаждали центрифугированием при 1500 об/мин 10 мин, осадок клеток использовали для выделения РНК. Надосадочную культуральную жидкость собирали для определения IFN и TNF методами иммуноферментного анализа (ИФА-наборы: «Альфа-ИФН», «Гамма-ИФН», «ФНО-альфа», ЗАО «Вектор-Бест»).

Противовирусную активность тестировали микрометодом в 96-луночных плато на монослойной культуре клеток ЛЭЧ-977 (легкие эмбриона человека, Медико-генетический центр РАМН). После инкубации клеток с двукратными разведениями проб (24 ч 37°С, 5 % СО2) культуральную жидкость удаляли, и клетки заражали вирусом энцефаломиокардита (ЭМК, 100 доз, ЦПД50). На следующий день учитывали результаты вирусного ЦПД в световом микроскопе. За титр IFN принимали обратную величину разведения пробы, вызывающей задержку ЦПД вируса на 50 %, и выражали числом ЕД/мл [12].

Транскрипцию мРНК Bcl-2, мРНК Fas-рецептора (CD95) и мРНК гамма-актина определяли полуколичественным методом ОТ-ПЦР. Использовали специфические праймеры, рассчитанные нами [6] по известной первичной структуре альфа- и бета-транскриптов мРНК гена B-клеточной лимфомы (bcl-2;NCBI accession M13994, M13995), мРНК Fas-рецептора (Fas; NCBI accession M67454) и мРНК транскриптов гена гамма-актина (ACTG1; NCBI accession M19283). Выделение РНК из очищенных лимфоцитов проводили c помощью набора «RNAgents Total RNA isolation system» (Promega) согласно инструкции. К осадку клеток добавляли буфер лизиса в объеме 500 мкл и экстрагировали в присутствии 0,2 М ацетата натрия, рН 5,5. РНК осаждали изопропанолом при -20°С, осадок промывали 70 % этанолом. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили на препарате суммарной РНК с универсальным праймером олиго(dT)15 (ЗАО «Силекс») в объеме 30 мкл при 42°С 1 ч. Инкубационная смесь ОТ содержала дАТФ, дГТФ, дТТФ и дЦТФ — 500 мкМ, фермент обратную транскриптазу (RT MuLV) — 300 ЕД, ингибитор РНК-азы (RNAsin) — 50 ЕД (реактивы фирмы Promega).

Аликвоты полученных кДНК разводили последовательно в 10 раз (10¹–10³) и добавляли в полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Результаты амплификации регистрировали в реальном времени на приборе «CFX-96» (BioRad) с последующим анализом ДНК-продуктов по кривой плавления и электрофорезом в агарозном геле с бромистым этидием (БЭ). Использовали смесь SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad). Сравнивали пороговые циклы логарифмического накопления амплификатов в опытных пробах с позитивным контролем (клетки без добавления препаратов). Негативным контролем была проба, не содержащая кДНК. Программа амплификации: 96°°С — 2 мин, затем 39 циклов: 94°С — 10 с, 52°С — 10 с, 72°С — 20 с. Изображения ПЦР-продуктов в гелях просматривали в УФ-трансиллюминаторе и фотографировали с помощью устройства «Gel Imager». Размеры специфического продукта bcl-2 — 209 н. п., Fas-рецептора — 532 н. п., гамма-актина — 681 н. п. устанавливали по положению в геле маркеров из набора ДНК 100-1000 н. п. (DNA-ladder, MBI «Fermentas», Латвия).

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление