Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2011, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2011

Олигонуклеотидный биочип для определения профиля экспрессии генов цитокинов человека

М.А. Плотникова, А.В. Васин, Е.Ю. Марочкина, С.А. Клотченко, Е.А. Романовская-Романько, А.-П.С. Шурыгина, В.В. Егоров, О.И. Киселев

Определение цитокинового статуса играет важную роль для понимания процессов протекания вирусных инфекций и природы патогенности вирусов. Целью работы была оценка возможности использования метода олигонуклеотидных биочипов для определения экспрессии цитокинов на уровне мРНК. Для этого был создан тестовый биочип с предварительно подобранными в программе OligoWiz иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, комплементарными последовательностям интерлейкина 10 (IL-10), интерферона γ (IFNγ) и фактора некроза опухолей (TNF) человека. Для амплификации флуоресцентно меченных кДНК была отработана методика ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к IL-10, IFNγ и TNF. Показано, что полученные кДНК специфически связывались с зондами на биочипе в процессе гибридизации. При этом интенсивность флуоресценции точек была пропорциональна концентрации пробы, что позволяет проводить полуколичественные ее оценки. Показано, что чувствительность метода выше, чем при использовании стандартной мультиплексной ОТ-ПЦР. Расширение спектра выявляемых цитокинов и введение в биочип внутренних контролей, таких как гены «домашнего хозяйства», позволит в дальнейшем использовать предложенный высокопроизводительный полуколичественный метод определения профиля экспрессии цитокинов в клинических и лабораторных исследованиях. (Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10. № 2. С. 5–9.)

Ключевые слова: цитокины, цитокиновый профиль, биочип.

Определение профиля экспрессии цитокинов играет важную роль в понимании процессов протекания вирусных инфекций и природы патогенности вирусов. В клинической практике исследование цитокинового статуса отражает индивидуальную первичную реакцию на вирус, позволяет охарактеризовать течение процесса инфекции и прогнозировать исход заболевания, а также оценить эффективность терапии, особенно в случаях применения средств с иммуномодулирующей активностью [1, 4]. Цитокины формируют сложную сеть взаимодействий, поэтому для точной характеристики природы иммунного ответа на патогены важно отслеживать уровень экспрессии максимально возможного числа участников цитокиновых каскадов. Нарушения в синтезе цитокинов могут приводить к катастрофическим последствиям. Например, показано, что клетки иммунной системы, действуя как эффекторы в защите против гриппа, могут вызывать иммунопатологию из-за повышенной секреции провоспалительных цитокинов в ответ на инфекцию, вызванную особо патогенными вирусами [6]. В этих условиях содержание цитокинов резко повышается не только в тканях, пораженных вирусами, но и в периферической крови. Это, в конечном итоге, приводит к так называемому цитокиновому шторму, или гиперцитокинемии, в результате которого в периферической крови развиваются системные повреждения и дисфункция эндотелия сосудов, что в короткие сроки приводит к системному поражению внутренних органов и смертельным исходам. Исследование уровня анти- и провоспалительных цитокинов в крови дает возможность не только проследить иммунный ответ организма на заболевание, но и проводить дополнительный контроль качества вакцин против гриппа на стадиях доклинических испытаний [7].

Методы определения цитокинов за последние 20 лет их интенсивного изучения быстро эволюционировали и сегодня представляют собой целую область научного знания [3]. Помимо множества широко используемых методов анализа цитокинов на уровне белкового продукта, таких как иммуноанализ, проточная цитофлуориметрия, вестерн-блоттинг, иммуногистохимия in situ, во многих случаях требуется проводить анализ на уровне продукции мРНК. Сочетание технологий гибридизации и обратной транскрипции (ОТ), совмещенной с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), позволило создать новый высокопроизводительный метод анализа экспрессии генов с помощью биочипов, когда в одном эксперименте можно оценить экспрессию сотен и тысяч генов [2]. В данной работе была проведена оценка возможности использования олигонуклеотидного биочипа для определения экспрессии генов цитокинов на примере интерлейкина 10 (IL-10), интерферона γ (IFNγ) и фактора некроза опухолей (TNF) человека.

Материалы и методы

Для получения цитокиновых мРНК выделяли полиморфноядерные лейкоциты на градиенте плотности фиколл–урографин из крови доноров, клетки (~106) заражали вирусом гриппа A/Kurgan/05/2005(H5N1) [8]. Через 8 ч клетки отбирали, отделяли их от питательной среды центрифугированием при 1500 g, удаляли супернатант, полученный осадок заливали 750 мкл реагента TRIzol (Invitrogen, USA) и оставляли на ночь, после чего тотальную РНК выделяли в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре «NanoDrop» (NanoDrop Technologies, USA).

Синтез кДНК проводили методом ОТ в объеме 25 мкл. К образцу РНК в количестве 1–2 мкг добавляли 1 мкл олиго(dT16) (10 ОЕ/мл) и dH2O до объема 10 мкл, затем проводили отжиг при +70°С в течение 5 мин в термошейкере «ComfortPlus» (Eppendorf, Germany), после чего пробы немедленно охлаждали на льду. Далее добавляли 15 мкл реакционной смеси, содержащей 200 ЕД. M-MLV ревертазы (Invitrogen, USA) в 1×ОТ-буфере и эквимолярную (по 500 мкМ) смесь четырех dNTP (ДНК-синтез, Россия). Реакцию ОТ проводили в течение 1 ч при 37°С. ПЦР проводили в 30 мкл реакционной смеси (2,5 ЕД. Taq-полимеразы в 1×Taq-буфере, 4 мМ MgCl2, 333 мM dNTP, 30 пмоль прямого и обратного праймеров, 1 мкл кДНК) в амплификаторе «MJ Mini» (BioRad, USA) по следующей программе: 95 °С – 4 мин; 10 циклов 95 °С – 30 сек, последовательное уменьшение с 62 °С до 57,5 °С с шагом 0,5 °С за цикл – 30 сек, 72 °С – 30 сек; 20 циклов 95 °С – 30 сек, 57 °С – 30 сек, 72 °С – 30 сек; 72 °С – 5 мин. Последовательности использованных в работе праймеров и олигонуклеотидных зондов (ДНК-синтез, Россия) приведены в табл. 1 и 2. Флуоресцентное мечение кДНК проводили в процессе ПЦР, как описано выше, за исключением того, что в реакционную смесь добавляли по 250 мкМ dАTP, dTTP, dGTP и 100 мкМ dCTP, 17 мкМ Cy5-dCTP (ДНК-синтез, Россия). В случае мультиплексной ПЦР использовали несколько прямых и обратных пар праймеров (по 30 пмоль).

Электрофоретическое разделение ПЦР продуктов проводили в 1 % агарозном геле с использованием 1× трис-боратного буфера в камере «Mini Sub Cell» (Bio-Rad, USA). Гели документировали с помощью системы «Kodak Image Station» (Kodak, USA).

Иммобилизацию олигонуклеотидных зондов в концентрации 500 мкг/мл проводили на альдегидные стекла «Vantage Aldehyde Slides» (CEL Associates) в 3×SSC буфере методом контактной печати на споттере «SpotBot 3» (ArrayIt, USA). Печать проводили иглой 946MP4 в условиях 55–60 % влажности при 22°С. После печати слайды оставляли на 1 ч при комнатной температуре, затем облучали ультрафиолетом (0,09 Дж/см2) с помощью кросслинкера «BioLink» (Biometra, Germany) при 254 нм.

Полученную в результате ОТ-ПЦР флуоресцентно меченную кДНК доводили dH2O до объема 30 мкл и инкубировали при 99°С 2 мин, охлаждали во льду 1 мин, добавляли 10 мкл 99 % формамида и 10 мкл буфера гибридизации. Гибридизацию полученной пробы с чипом проводили с использованием специальных рамок с лунками объемом 50 мкл (Whatman, USA) в течение 2 ч при температуре 37°С с перемешиванием при 250 об/мин на термошейкере «ComfortPlus» (Eppendorf, Germany). Слайды предварительно инкубировали в кипящей dH2O в течение 1 мин. После гибридизации слайды отмывали от несвязавшихся молекул пробы и буфера гибридизации в 1×SSC/0,1 % SDS буфере, после чего сушили центрифугированием в течение 4 мин при 800 g.

Сканирование биочипов проводили на сканере «ScanArray Express» (Perkin-Elmer, USA) с разрешением 5 мкм и PMT в пределах 60–90 при длинах волн 633 нм (рассеивающее сканирование) или 670 нм (Cy5). Обработку получаемых изображений проводили с использованием прилагающегося программного обеспечения.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление