Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2011, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2011

Стимуляция синтеза иммуноглобулинов в культуре периферических мононуклеарных клеток крови под действием растворимого рецептора интерлейкина 8 человека CXCR2

Ю.В. Котлинская, К.В. Котлинский, Ю.В. Чалый, А.М. Шолух, Н.Н. Войтенок

Интерлейкин-8 (IL-8) является основным хемотактическим фактором для нейтрофильных лейкоцитов (НЛ) при воспалении. Ранее авторами было показано, что фактор некроза опухолей α, а также фагоцитарные стимулы вызывают резкое снижение экспрессии рецептора IL-8 второго типа CXCR2 на мембране НЛ и появление растворимого антигена CXCR2 в супернатанте. Растворимый CXCR2 (sCXCR2) является кислым гликопептидом с молекулярной массой 14–17 кДа и изоэлектрической точкой 3,2. В данной работе мы изучили влияние sCXCR2 на синтез общего иммуноглобулина (Ig) в культуре мононуклеарных клеток крови человека. Мононуклеары инкубировали в течение 24 ч с F(ab’)2-фрагментами кроличьих антител против Fab-фрагментов Ig G человека, затем 7 сут в присутствии sCXCR2. Синтез общего Ig в культуре оценивали с помощью иммуноферментного анализа с использованием F(ab’)2-фрагментов кроличьих антител против Fab-фрагментов Ig G человека, синтез ДНК оценивали по включению 3Н-тимидина. sCXCR2 достоверно стимулировал синтез общего Ig в культуре мононуклеарных клеток с выраженным дозозависимым эффектом. Очистка мононуклеаров от CD14+ моноцитов c помощью фагоцитоза карбонильного железа снизила продукцию Ig в ответ на стимуляцию растворимым CXCR2, тогда как стимуляция синтеза Ig в ответ на липополисахарид или бактерии Staphylococcus aureus Cowan I существенно не изменилась. sCXCR2 не стимулировал синтез ДНК в культуре мононуклеаров, т. е. его действие не было связано с пролиферацией клеток. Полученные данные позволяют предположить, что при воспалительном ответе на проникновение патогенных микроорганизмов sCXCR2, продуцируемый нейтрофилами, может повышать эффективность защитной реакции организма путем стимуляции синтеза общего Ig и, возможно, специфических антител В-клетками. (Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10. № 2. С. 10–14.)

Ключевые слова: интерлейкин 8, нейтрофилы, мононуклеарные клетки, растворимый рецептор IL-8 CXCR2, синтез иммуноглобулинов.

Миграция нейтрофилов в участок воспаления направляется специализированными белковыми молекулами, хемотактическими цитокинами или хемокинами [3]. Основным хемокином для нейтрофилов является интерлейкин 8 (IL-8/CXCL8), белок размером 8 кДа, который синтезируется различными клетками иммунной системы в ответ на инфекцию. IL-8 действует на клетки через мембранные рецепторы первого (CXCR1) и второго (CXCR2) типов. CXCR1 и CXCR2 относятся к «серпентиновому» семейству рецепторов, связанных с G-белками, содержат семь трансмембранных петель, внеклеточный N-концевой домен, участвующий в связывании лиганда, и внутриклеточный С-концевой участок, ответственный за передачу сигнала внутрь клетки [3].

В наших предыдущих исследованиях было впервые показано, что снижение уровня экспрессии CXCR2 на поверхности нейтрофилов при фагоцитозе микроорганизмов [6] или под действием фактора некроза опухолей α (TNFα) [12] сопровождается появлением растворимого CXCR2 (sCXCR2) в супернатанте активированных клеток [1]. По данным гель-проникающей хроматографии, sCXCR2 имеет молекулярную массу 35–40 кДа [2]. Анализ растворимого рецептора с помощью электрофореза в денатурирующих условиях показал, что молекулярная масса растворимого рецептора составляет 14–17 кДа [2]. Показано, что sCXCR2 N-гликозилирован, имеет низкое значение изоэлектрической точки и может накапливаться в участках воспаления [1, 2]. Выявленный в моче растворимый рецептор идентичен sCXCR2, выделенному из супернатанта активированных нейтрофилов [1].

Известно, что анионные макромолекулы способны активировать моноциты, макрофаги и В-лимфоциты. В культуре В-лимфоцитов такие соединения могут стимулировать пролиферацию и синтез иммуноглобулинов (Ig) [4].

Кроме того, известно, что в результате протеолитического отщепления рецепторы некоторых цитокинов, например, рецепторы TNF, переходят в растворимую форму, сохраняют способность связывать лиганды и принимают участие в регуляции воспаления [7]. При этом отщепление некоторых рецепторов может приводить к появлению новых цитокинов, как в случае CX3CL1 (фракталкина) и CXCL16, которые синтезируются как трансмембранные молекулы адгезии, а после протеолитического отщепления приобретают хемотактические свойства [7].

В данной работе мы изучили влияние sCXCR2 на синтез общего Ig в культуре мононуклеарных клеток человека. Фракция мононуклеаров крови содержит основные типы клеток, участвующие в развитии иммунного ответа: Т- и В-лимфоциты, а также моноциты, дифференцирующиеся в ткани в макрофаги.

Материалы и методы

В качестве основного объекта исследования были выбраны мононуклеары периферической крови человека. Кровь здоровых доноров стабилизировали гепарином и наслаивали на одноступенчатый градиент Histopaque («Sigma»). После центрифугирования 30 мин при 400 g слой клеток, находящийся в интерфазе, отбирали и дважды отмывали. Для удаления фагоцитирующих моноцитов суспензию выделенных мононуклеаров инкубировали со взвесью частиц карбонильного железа («Sigma»). После инкубации в течение 1 ч при 37°С на водяной бане с осторожным постоянным перемешиванием взвесь частиц железа и фагоцитировавшие клетки удаляли сильным магнитом. Клетки инкубировали в концентрации 5 млн/мл с F(ab')2-фрагментами кроличьих антител против Fab-фрагментов Ig человека (F(ab') 2−анти−Fab), в среде RPMI-1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики и меркаптоэтанол, как описано [5]. После 24 ч инкубации клетки трижды отмывали и инкубировали в 96-луночном планшете в присутствии исследуемых факторов. После 7 дней инкубации клеточные супернатанты отбирали. Продукцию Ig анализировали методом иммуноферментного анализа (ИФА). Жизнеспособность клеток на всех этапах эксперимента составляла более 95% по отношению к соответствующим контрольным образцам (по данным колориметрического теста с использованием витального красителя AlamarBlue).

Синтез ДНК в культурах мононуклеаров определяли с помощью 3Н-тимидина. 3Н-тимидин вносили в культуры мононуклеаров по 2 мкКи/мл (уд. радиакт. 40 МБк/моль) и инкубировали 4 ч при 37°С [11].

Для получения F(ab')2−анти–Fab применяли следующую схему: Fab-фрагменты IgG человека получали методом ферментативной обработки папаином фракции человеческого Ig для внутривенного введения («Octapharma»). Полученными Fab-фрагментами человека иммунизировали кролика. Иммунную сыворотку обрабатывали пепсином по методу R.G. Jones [8]. Последующее аффинное выделение F(ab')2−анти–Fab проводили на колонке с иммуносорбентом на основе Сефарозы-4В («Amersham Biosciences»), связанной с Fab-фрагментами IgG человека. Часть полученных F(ab')2-фрагментов кроличьих антител конъюгировали с NHS-биотином («Pierce»). Для удаления Fc-фрагментов и полноразмерных молекул Ig, содержащих Fc-фрагмент, образцы пропускали через колонку с иммобилизованным белком А с последующим переводом в фосфатно-солевой буфер. Чистоту полученных фрагментов контролировали электрофоретически, согласно методу U.K. Laemmli [10].

Выделение sCXCR2 из мочи здоровых доноров проводили методом иммуноаффинной сорбции с использованием моноклонального антитела (МКА) А, распознающего аминокислоты 12–16 в составе N-концевой последовательности CXCR2 [1]. После иммуноаффинной сорбции элюат, содержащий растворимый CXCR2, концентрировали на мембранных концентраторах и очищали с помощью гель-проникающей хроматографии на колонке Zorbax GF-250 хроматографа высокого давления («Agilent»). На всех этапах очистки содержание sCXCR2 оценивали методом конкурентного ИФА с МКА А [1].

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление