Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2011, № 3

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 3'2011

Экспрессия мРНК хемокинов и хемокиновых рецепторов и содержание цитокинов в крови здоровых добровольцев

К.А.Сысоев

В последнее время растет интерес к регуляторным функциям иммунной системы. Система хемокинов — разнообразный и сложный механизм, обеспечивающих активацию и физиологическое состояние клеток. Цель исследования состояла в оценке состояния системы хемокинов у здоровых добровольцев. В настоящем исследовании представлены результаты изучения экспрессии мРНК эотаксина, эотаксина-2, IL-8, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1 и CXCR2 в клетках периферической крови, а также данные о содержании в плазме IL-1β, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, эотаксина, FGF-2, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNFα и VEGF у 19 практически здоровых лиц. Были проведены сопоставления между экспрессией мРНК хемокинов и содержанием цитокинов. Полученные данные позволяют охарактеризовать систему хемокинов как разветвленный и гибкий инструмент поддержания постоянства внутренней среды организма. Найденные взаимосвязи указывают на хемокины как на систему активации и подавления реактивности в ответ на внутренние и внешние стимулы. (Цитокины и воспаление. 2010. Т. 10. № 3. С. 91–97.)

Ключевые слова: хемокины, цитокины, рецепторы, здоровые доноры.

Хемокины представляют собой пептиды, ответственные за привлечение, миграцию и взаимодействие лейкоцитов. В последнее время растет интерес к гомеостатическим функциям хемокинов, таким как имплантация эмбриона, регуляция сигнальных путей и поддержание системы врожденного иммунитета. Хемокины, действуя через специфические GPCR-рецепторы, обладают функциональной избыточностью и перекрывают собственные эффекты. Ростовые факторы, колониестимулирующие цитокины, иммунорегуляторные медиаторы совместно с хемокинами обеспечивают сложную систему регуляции гомеостаза. Представляется актуальным изучить экспрессию мРНК хемокинов и хемокиновых рецепторов клетками периферической крови здоровых добровольцев, а также содержание 27 цитокинов (включая хемокины) в плазме. Взаимосвязи между экспрессией мРНК и содержанием биологически активных молекул могут объяснить механизмы обеспечения физиологического состояния организма человека.

Сопоставление экспрессии мРНК и продукции хемокинов в крови важно для понимания процессов регуляции и активации иммунной системы. Так, экспрессия мРНК не всегда означает, что белок, синтезируемый invivo, будет обладать в полной мере присущей ему биологической активностью. Hu Z. [7] показано, что микроРНК способны прекращать трансляцию белка с генной матрицы. По данным Perry M.M. и соавт. [16], микроРНК-146a подавляют стимулированный IL-1β синтез IL-8 и RANTES на посттранскрипционном уровне.

Материалы и методы

В настоящем исследовании мы оценили экспрессию мРНК эотаксина, эотаксина-2, IL-8, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1 и CXCR2 в периферической крови, кроме того, мы определили концентрацию IL-1β, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, эотаксина, FGF-2, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNFα и VEGF в плазме крови 19 практически здоровых лиц. Все добровольцы прошли углубленное медицинское обследование, при котором не было выявлено никаких заболеваний. Половая принадлежность добровольцев — 10 женщин и 9 мужчин, средний возраст составил 30,4±8,3 г.

Исследование мРНК хемокинов и рецепторов. Кровь с добавлением ЭДТА, взятую из кубитальной вены, в количестве 100 мкл вносили в пробирку типа «Эппендорф». Добавляли 1400 мкл ТЕ-буфера, перемешивали на вортексе и оставляли для инкубации при комнатной температуре на 3 мин. Далее центрифугировали в течение 1 мин при 14000 об/мин, после чего сливали надосадок. Процедуру отмывки ТЕ-буфером повторяли еще дважды. Далее к осадку добавляли 300 мкл лизирующего раствора и инкубировали пробирку при 65 °C в течение 15 мин. Далее добавляли 400 мкл изопропанола и перемешивали пробу на вортексе в течение 3-5 сек. Центрифугировали пробирку при 14000 об/мин в течение 5 мин. Удаляли надосадочную жидкость. Добавляли к осадку 500 мкл 70% раствора этанола и 3–5 раз аккуратно переворачивали пробирку. Центрифугировали пробирку при 14000 об/мин в течение 5 мин. Удаляли надосадочную жидкость. Добавляли к осадку 500 мкл ацетона и 3–5 раз аккуратно переворачивали пробирку и центрифугировали ее при 14000 об/мин в течение 5 мин. Удаляли надосадочную жидкость. Открывали крышку пробирки и высушивали осадок при 65 °C в течение 5 мин. Добавляли к осадку 50 мкл ДЭПК-H2O и прогревали пробу при 65 °C в течение 10 мин. Обратную транскрипцию проводили с помощью набора «Реверта» (ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва) согласно инструкции производителя.

Следующим этапом была постановка ПЦР со специфическими праймерами (табл. 1). Режим ПЦР: 95 °C — 4 мин, 30 °C (95 °C — 30 с, 60 °C — 30 с, 72 °C — 30 с), 72 °C — 7 мин.

В качестве референс-гена использовался бета-актин. Визуализацию полученных ПЦР-продуктов осуществляли в агарозном геле при УФ освещении. Полуколичественную оценку проводили с помощью программы Gel-Pro, принимая за 100% интенсивность флюоресценции бета-актина.

Мультиплексное определение цитокинов.Дляопределенияцитокинов использовали оборудование и реактивы Bio-Rad (Bio-Plex Suspension Array System).Пользовались стандартной панелью на 27 цитокинов. Плазму крови, взятую с ЭДТА, вносили в лунки планшета. Далее действовали согласно инструкции производителя.

Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 (использовали описательную статистику, корреляционный анализ Спирмена при уровне значимости р<0,05).

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление