Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2011, № 3

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 3'2011

Нарушение фагоцитоза и его фармакокоррекция при геморрагическом инсульте

А.Е. Кульчиков, С.Г. Морозов, Е.А. Гриненко, А.Н. Макаренко

Изучали особенности нарушения фагоцитарного звена иммунитета при экспериментальном геморрагическом инсульте (ЭГИ) и коррекцию нарушений фагоцитоза с помощью препарата церебролизин («EVER NEURO PHARM», Австрия), оказывающего нейротрофическое и иммунокорректирующее действие. Исследование выполнено на 42 крысах линии Вистар с ЭГИ, у которых изучали способность макрофагов селезенки и перитонеального экссудата к фагоцитозу, восстановлению НСТ и адгезии. Показано, что у животных с ЭГИ возникают нарушения фагоцитоза, которые проявляются снижением функциональной активности, уровня спонтанной и индуцированной активности и увеличением адгезивной способности макрофагов селезенки и перитонеального экссудата. Применение церебролизина (внутрибрюшинно, в дозе 2,5 мл/кг массы тела животного, в течение 7 дней после воспроизведения инсульта) способствовало восстановлению нарушенных показателей фагоцитарного звена иммунитета. Следовательно, данное исследование свидетельствует о наличии прямого иммунокорригирующего действия церебролизина на нарушенную фагоцитарную активность фагоцитов в условиях инсульт-индуцированного иммунодефицита. (Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10. № 3. С. 102–107.)

Ключевые слова: экспериментальный геморрагический инсульт, нарушение фагоцитоза, церебролизин, иммунокоррекция.

На современном этапе развития общества отмечена тенденция к увеличению частоты развития геморрагического инсульта (ГИ), который все чаще встречается в более молодом возрасте [2, 6, 7, 19, 22]. Одной из основных причин смерти при ГИ является развитие инфекционно-воспалительных осложнений, таких как пневмония, инфекция мочевыделительной системы, менингиты и менингоэнцефалиты [3, 17]. По мнению ряда авторов, инфекционно-воспалительные осложнения возникают вследствие сочетанного действия ряда неблагоприятных факторов (гибели нервных клеток, дисстресса, нарушения нейроиммунного гомеостаза мозга, развития аутоиммунных реакций), приводящих к развитию вторичного иммунодефицита (ИДС) [8, 13, 14, 16, 18, 25]. В условиях вторичного ИДС активируется размножение условно патогенной и патогенной микрофлоры, что, в свою очередь, усугубляет течение основного заболевания, усиливает иммунную депрессию из-за накопления бактериальных и вирусных токсинов, протеолитических ферментов и медиаторов воспаления [13, 16, 25]. Таким образом, формируется замкнутый патологический круг, при котором лечение оказывается малоэффективным, а течение заболевания заканчивается летальным исходом [3]. По данным исследователей, иммунодефицит при инсульте состоит из аутоиммунных реакций, депрессии клеточного и неспецифического звена иммунитета и, как ответ на воспаление, — активации гуморального звена [8, 10–13, 25]. Формирование в процессе эволюции иммунной (защитной) системы началось с появления неспецифического звена иммунитета, где ключевую роль играют фагоциты [8, 13, 25]. Именно фагоциты являются одним из ключевых звеньев в формировании иммунного ответа, выступая в качестве антиген-презентирующей клетки и первой линии защиты от чужеродных агентов. В литературе есть данные, указывающие на ослабление фагоцитарной активности при ишемическом инсульте, осложненном нозокомиальной пневмонией [11, 12, 16–18]. Все это указывает на целесообразность изучения фагоцитарного звена иммунитета при ГИ и необходимость разработки способов рациональной фармакокоррекции данных нарушений. Однако в литературе отсутствуют данные о функциональной активности фагоцитов периферических органов иммунной системы и тканевых макрофагов при ГИ. С другой стороны, для эффективной фармакокоррекции нарушений иммунного ответа при ГИ целесообразно использовать средства, оказывающие комплексное влияние как на ЦНС, так и на иммунную систему. К таким препаратам относится церебролизин. По многочисленным данным церебролизин, помимо нейротрофического действия, обладает и иммунокорригирующим действием и является нейроиммунокорректором [1, 4, 5, 9–12, 23, 24].

В связи с этим целью настоящего исследования было изучение функциональной активности фагоцитов селезенки и перитонеального экссудата при ЭГИ и способы фармакокоррекции нарушенного фагоцитарного звена с помощью церебролизина — ноотропа с нейротрофическим и иммунокорректирующим действием.

Материалы и методы

Этические аспекты.Все работы с животными были проведены согласно Директивы Совета Европейского общества (86/609/ЕЕС) об использовании животных в экспериментальных целях [26].

Объект исследования. В эксперименте использованы 49 крыс Вистар (самки, возраст 4 месяца, масса 200–220 г). Все исследования с животными проводили в осеннее время года.

Дизайн исследования. Перед началом эксперимента животные были разделены на пять групп, каждая из которых состояла из 7 животных. 1-я группа — контроль (интактные животные). 2-я группа — ложнооперированные животные. 3-я группа — животные с ГИ. 4-я группа — животные с ГИ+плацебо. 5-я группа — животные с ГИ+церебролизин. Крыс всех групп подвергали оперативному вмешательству с целью воспроизведения инсульта. Церебролизин и плацебо (физиологический раствор) вводили через 5 ч после воспроизведения ГИ, затем 1 раз в сутки в течение 7 дней. После этого животных забивали под эфирным наркозом (стадия III2-3) и проводили исследования иммунного статуса.

Моделирование ЭГИ. Для моделирования экспериментального монополушарного ГИ у крыс, наркотизированных диэтиловым эфиром (стадия III2-3) производили рассечение покровных тканей в лобной, теменной и затылочных областях, удаляли надкостницу с костей свода черепа, после чего проводили трепанацию черепа. В области правой внутренней капсулы (координаты: H=4,0 мм; L=3,0 мм; A=1,5 мм; от брегмы), по атласу Paxinos G. et al., осуществляли деструкцию мозговой ткани и повреждение сосудов с помощью 5–6 вращательных движений мандрена-ножа, введенного через направляющую иглу-канюлю (рис. 1) [15, 27]. После этого операционную рану зашивали. За состоянием животных наблюдали в течение суток. Животным 2-й группы проводили наркотизацию, скальпирование и трепанацию черепа.

Введение препарата. Препарат церебролизин вводили внутрибрюшинно в дозе 2,5 мл/кг массы тела животного 1 раз в день ежедневно в течение 7 дней, плацебо (физиологический раствор) вводили в том же объеме, что и лекарственный препарат.

Морфологический контроль.Для проведения морфологического контроля субнеокортикального повреждения мозга из каждой группы использовали по одному животному, у которого, помимо проведения исследования иммунной системы, брали головной мозг для гистологических исследований. Оценку объема инсультного повреждения, степени нейродегенеративных процессов и контроль топологии очага внутримозговой гематомы производили по фронтальным срезам мозга. Мозг крыс фиксировали в 10% растворе формалина, подвергали стандартной гистологической проводке, выполняли срезы на микротоме Historange (LKB) толщиной 6 мкм с шагом 200 мкм, после чего срезы окрашивали по методу Ниссля.

Оценка состояния фагоцитарного звена иммунитета.

1. Показатели фагоцитарной активности макрофагов селезенки и макрофагов перитонеального экссудата определяли с помощью проточной цитометрии на основе количественной оценки поглощенных меченных флюорохромом бактерий. Оценку фагоцитарной активности клеток проводили, используя штамм St. aureus, меченный флюоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ). Для этого 90 мкл St. аureus, меченного ФИТЦ, в концентрации 109/мл вносили в пробирки для проточной цитометрии, добавляли равный объем клеток в концентрации 2×106/мл, предварительно освобожденных от эритроцитарной массы при помощи лизируюшего раствора 0,9% NH4Cl. В качестве контроля использовали клеточную суспензию в концентрации 2×106/мл без добавления St. аureus. Пробы инкубировали в течение 30 мин при 37 °С, после чего добавляли к каждому образцу по 2 мл охлажденного забуференного физиологического раствора и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 400 мкл 0,4% раствора формалина. С помощью проточноцитометрического гейтирования определяли относительное количество фагоцитирующих клеток. Все проточноцитометрические анализы проведены на приборе FACSсаlibur («Bеcton Dickinson», USA), оборудованном аргоновым лазером с длиной волны 488 нм, с использованием программы CellQuest для получения и анализа данных. Для измерения флуоресценции фикоэритрина и иодида пропидия (РІ) использовали узкополосный фильтр 585/42 нм, флуоресценции ФИТЦ — 642/75 нм [20, 21].

Фагоцитарную активность выражали в виде процента клеток, поглотивших меченые микробы.

2. Уровень метаболической активности макрофагов селезенки и брюшной полости (спонтанной, а также индуцированной зимозаном и эфиром форболмиристатацетата) оценивали по восстановлению макрофагами нитросинего тетразолия (НСТ), с помощью НСТ-теста. Этот тест является показательным для оценки эндогенной активации макрофагов в различных органах invivo(спонтанная активность) и для оценки внутреннего метаболического ресурса клеток, проявляющегося при активации различными стимулирующими веществами invitro (индуцированная активность). Для определения НСТ-восстанавливающей метаболической активности перитонеальные макрофаги вносили в лунки 96-луночного плоскодонного пленшета по 1×105 клеток на лунку. Для определения спонтанной активности клеток в лунки добавляли по 0,1 мл 0,2 % красителя НСТ, для определения индуцированной активности — по 0,1 мл 0,2% НСТ и 0,02 мл зимозана (3 мг/мл) или по 0,1 мл 0,2% НСТ и 0,02 мл форболмиристатацетата. Клетки инкубировали 1 ч при 37 °С в присутствии 5% СО2. После инкубации планшет центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок промывали добавлением 0,2 мл метанола. Повторно центрифугировали, и после удаления надосадочной жидкости в лунки добавляли 0,1 мл 0,1 н KOH и 0,1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения диформазана. Содержимое проб аккуратно пипетировали и проводили учет результатов спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Спонтанную и индуцированную (зимозаном или форболовым эфиром) метаболическую активность перитонельних макрофагов выражали в условных единицах, которые вычисляли путем умножения показателей экстинкции на 1000.

3. Оценку адгезивных свойств перитонеальных макрофагов проводили следующим образом: в лунки плоскодонного 96-луночного планшета вносили по 100 мкл клеточной суспензии с концентрацией 2×106/мл и инкубировали в течение 60 мин, после чего адгезировавшие клетки фиксировали 30 мин этиловым спиртом. После промывки адгезировавшие клетки окрашивали фиолетовым кристаллическим и оценивали колориметрическим методом количество прикрепленных клеток после растворения красителя в ДМСО при длине волны 570 нм. Для оценки функционального резерва адгезии клетки стимулировали путем добавления форболмиристатацетата (модифицированная адгезия).

Статистическая обработка. Статистический анализ проводили с использованием программ Biostat и Statistica 6.0. Все значения даны в виде средних арифметических и стандартных отклонений (M±SD). Достоверность различий результатов устанавливали с помощью t-критерия Стъюдента.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление