Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2011, № 3

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 3'2011

Комбинированное применение интерферона альфа-2b, антиоксидантов и специфических противовирусных химиопрепаратов защищает от летальной герпесвирусной инфекции

Р.Р. Климова, В.В. Малиновская, Е.Н. Выжлова, Ю.А. Тюленев, А.А. Кущ

Вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус (ЦМВ) чрезвычайно широко распространены в человеческой популяции и могут поражать различные органы и ткани. Особую опасность ВПГ- и ЦМВ-инфекции представляют для беременных женщин и для новорожденных детей. Основными недостатками противовирусных химиопрепаратов являются их высокая токсичность, ограниченная биодоступность и, при длительном использовании, — развитие лекарственной устойчивости. В настоящее время проводится поиск новых средств и новых схем терапии, позволяющих избежать проявления побочных токсических эффектов при сохранении высокой противовирусной эффективности. Целью настоящего исследования была оценка эффективности схемы мультимодальной терапии герпесвирусной инфекции новой лекарственной формой (НЛФ) ВИФЕРОН®, раствор для местного применения, в сочетании со специфическими противовирусными химио-препаратами in vitro и in vivo. Впервые установлено, что использование НЛФ в концентрации 20 000 МЕ/мл ингибирует ЦМВ-инфекцию в терапевтической схеме invitro на 83%. Показано, что НЛФ усиливает специфическую противовирусную активность химиопрепаратов, позволяя значительно снизить эффективную ингибирующую концентрацию последних: для ГЦВ — в 3 раза, для АЦВ — в 20 раз. В экспериментах in vivo продемонстрировано, что НФЛ не оказывает токсического действия на организм животных. Однократно введение НФЛ через 24 ч после внутрибрюшинного заражения мышей ВПГ1 защищает 60 % животных от летальной (20 ЛД50) герпесвирусной инфекции. Комбинированное использование НФЛ и АЦВ в лечебной схеме invivo позволило: а) уменьшить дозы обоих препаратов в 10 раз (до 2000 МЕ/мл и 5 мг/кг, соответственно) по сравнению с применением каждого препарата в отдельности; б) достичь лечебного эффекта при использовании короткой схемы терапии — 3 сут; в) обеспечить полную защиту (100%) животных от летального заражения (20 ЛД50/мл) ВПГ1. Высокий протективный эффект мультимодальной терапии летальной герпесвирусной инфекции invivo обусловлен синергидным характером взаимодействия использованных препаратов. (Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10. № 3. С. 113–121.)

Ключевые слова: вирус простого герпеса, цитомегаловирус человека, новая лекарственная форма ВИФЕРОН.

Вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус (ЦМВ) чрезвычайно широко распространены в человеческой популяции и могут поражать различные органы и ткани. У лиц со сниженным иммунитетом герпесвирусные инфекции (ГВИ) часто приводят к тяжелым осложнениям, нередко — со смертельным исходом. Особую опасность ВПГ- и ЦМВ-инфекции представляют для беременных женщин и новорожденных детей. В настоящее время существует несколько патентованных лекарственных препаратов, применяемых при лечении ГВИ, однако большинство из них не разрешены для лечения беременных женщин и новорожденных детей [15]. Основными недостатками химиопрепаратов являются их высокая токсичность, ограниченная биодоступность и, при длительном использовании, — развитие лекарственной устойчивости [14]. В связи с этим в настоящее время проводится поиск новых средств и схем терапии, которые позволили бы избежать проявления побочных токсических эффектов при сохранении высокой противовирусной эффективности. Одно из направлений, развиваемых в этой области исследований, состоит в разработке принципов мультимодальной терапии, значение которой заключается в одновременном воздействии на различные функции организма больного. В связи с этим для лечения ГВИ представляло интерес изучение эффективности комбинированного применения препарата, содержащего интерферон альфа-2b в комплексе с антиоксидантами (иммуномодулятора Виферон), и специфических химиопрепаратов. Интерферон альфа-2b обладает широким спектром противовирусной активности, а также иммуномодулирующими и антипролиферативными свойствами. В настоящий момент на территории России зарегистрирован препарат ВИФЕРОН®, содержащий интерферон альфа-2b в комплексе с антиоксидантами в разных лекарственных формах (суппозитории ректальные, мазь для наружного и местного применения, гель для наружного и местного применения). Препараты под торговым наименованием ВИФЕРОН® разрешены для лечения широкого спектра заболеваний у взрослых и детей, в том числе у беременных женщин и новорожденных детей. Недавно была разработана новая лекарственная форма (НЛФ) — ВИФЕРОН®, раствор для местного применения, включающая интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, комплекс антиоксидантов и вспомогательные вещества. Ранее была показана активность НЛФ против ВПГ-инфекции в клеточной системе in vitro при профилактическом использовании [2, 18].

Целью настоящего исследования была оценка эффективности схемы мультимодальной терапии ГВИ НЛФ ВИФЕРОН®, раствор для местного применения, в сочетании со специфическими противовирусными химиопрепаратами in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Мыши. Опыты проводили на мышах линии DBA, самках с массой тела 18–22 г, полученных из Центрального питомника лабораторных животных «Крюково» РАМН.

Культуры клеток. В работе использовали первичную культуру диплоидных фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) и перевиваемую линию клеток Vero, полученные из лаборатории клеточных культур ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. Клетки ФЛЭЧ культивировали в среде DMEM («ПанЭко», Россия), клетки Vero — в среде Игла MEM («ПанЭко», Россия) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, «ПанЭко», Россия), 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», Россия), 50 мкг/мл гентамицина («Пан-Эко», Россия).

Вирусы. Использовали референс-штамм ЦМВ человека AD 169 и референс-штамм F ВПГ1, любезно предоставленные проф. D. Emanuel (США) и проф. L. Pereira (США), соответственно. ЦМВ размножали и титровали на культуре клеток ФЛЭЧ, ВПГ — на культуре клеток Vero по общепринятой методике.

Определение инфекционной активности ВПГ и ЦМВ. Инфекционный титр ВПГ и ЦМВ определяли в культуре клеток модифицированным методом бляшек. Для титрования готовили образцы вируса и вносили в 96-луночные планшеты с монослоем клеток Vero (ВПГ) или ФЛЭЧ (ЦМВ). Панели с материалом инкубировали при 37 °С в течение 7 дней. Очаги инфицированных клеток (бляшки) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных антител (МКА) к белкам ВПГ или ЦМВ [3, 4]. Титр вируса определяли по формуле А=аxb/v, где А — число бляшкообразующих единиц на клетку в 1 мл (БОЕ/мл); a — среднее число бляшек на одну лунку; b — разведение вируса; v — объем вносимого вируссодержащего материала. Титр вируса составлял, в среднем, 1×107 БОЕ/мл для ВПГ и 1×105 БОЕ/мл для ЦМВ.

Препараты. В работе использовали следующие препараты: ганцикловир (ГЦВ), (цимевен®, «Рош», Швейцария), исходная концентрация 500 мг/мл; ацикловир (АЦВ) (зовиракс®, «ГлаксоСмитКляйн», Великобритания), исходная концентрация 250 мг/мл; интерферон альфа-2b (НЛФ ВИФЕРОН®, раствор для местного применения, 40000 МЕ/мл, ООО «ФЕРОН», Россия). Препарат ВИФЕРОН®, раствор для местного применения, в качестве действующего вещества содержит интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный 40000 МЕ/мл, а также компоненты, обладающие антиоксидантными свойствами (димеркаптопропансульфонат натрия (унитиол) и моногидрат лимонной кислоты) и другие вспомогательные вещества.

Определение цитотоксичности исследуемых препаратов. Оценку цитотоксичности исследуемых препаратов проводили следующим образом: к сформированному на стандартных 96-луночных планшетах клеточному монослою добавляли последовательные разведения приготовленных растворов исследуемых препаратов с конечной концентрацией 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,1 мг/мл для ГЦВ и АЦВ и 5 000, 10 000, 20 000 и 40 000 МЕ/мл для НЛФ. За 50% тканевую цитотоксическую дозу (ЦД50) принимали такую концентрацию препарата, которая вызывала гибель 50% клеток на третьи сутки после внесения образцов.

Оценка противовирусного действия препаратов invitro. Противовирусную активность препаратов анализировали в лечебной схеме. Химиопрепараты (ГЦВ и АЦВ) изучали в 5 концентрациях: 100, 10, 1,0, 0,2 и 0,1 мкг/мл. НЛФ исследовали в двух концентрациях: 20000 и 10000 МЕ/мл. Для определения противовирусной активности препаратов клетки ФЛЭЧ заражали ЦМВ с инфекционной множественностью (ИМ) 0,01 БОЕ/мл, клетки Vero — ВПГ1 с ИМ 0,001 БОЕ/мл. Для оценки комбинированного противовирусного эффекта препараты вносили в разных концентрациях и сочетаниях. В качестве контроля использовали зараженные клетки, не обработанные препаратами. Противовирусную активность веществ определяли по степени ингибирования цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов, которую выражали в %. Концентрацию соединения, подавляющую ЦПД на 50% по отношению к контролю, принимали за ингибирующую дозу (ИД50). Индекс селективности (ИС) рассчитывали как отношение ЦД50 к ИД50.

Анализ токсичности НЛФ invivo изучали на беспородных мышах при интраназальном введении в концентрации 4000, при внутрижелудочном введении — в концентрации 10000 и внутрибрюшинном введении — в концентрации 20000 МЕ/мышь. В каждой группе использовали по 12 животных. Анализировали следующие показатели: масса тела, гибель и общее состояние животных, гематологические и биохимические показатели крови, анализ мочи и патоморфологическое исследование органов и тканей. Животных наблюдали в течение 28 сут.

Изучение протективных свойств препаратов invivo. Защитное действие препаратов против ВПГ исследовали в лечебной схеме, используя 13 групп животных по 10 мышей линии DBA в каждой группе. Мышей заражали внутрибрюшинно ВПГ1, вводя по 20 50% летальных доз в 1 мл (20 ЛД50/мл). Лечение начинали через 24 ч. Количества препаратов и продолжительность их введения представлены в разделе «Результаты». Лечебные свойства оценивали по способности исследуемого вещества защищать животных от летального заражения ВПГ1. Наблюдение проводили в течение 21 дня.

Определение противовирусной активности комбинации АЦВ и НЛФ invivo. Концентрации одного вещества и другого в комбинации и по отдельности, которые приводили к 50% защите животных, обозначали как 50% эффективную дозу (ЭД50). Для оценки эффективности комбинации использовали понятие индекса суммарной фракционной ингибирующей концентрации (ФИК), значение которого вычисляли по формуле: индекс ФИК=ФИКА+ФИКБ, где ФИКА равен отношению ЭД50АЦВ в комбинации к ЭД50АЦВ, ФИКБ равен отношению ЭД50НЛФв комбинации к ЭД50НЛФ.

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов осуществляли, применяя двусторонний точный критерий Фишера и критерий χ2. Различия показателей считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление