Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2012, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2012

Иммуноцитохимическое исследование интерлейкина 1β в эпителиоцитах десен при хроническом генерализованном пародонтите

А.И. Парфёнов, Я.Я. Мазурова, Ю.А. Грухин, В.Ю. Кравцов

С помощью моноклональных антител проведено иммуноцитохимическое исследование IL-1β в эксфолиатах с поверхности зубодесневой бороздки у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом и у лиц со здоровым пародонтом. Визуализированный иммуноцитохимической реакцией IL-1β обнаруживается только в эпителиоцитах. Иммуноцитохимическое исследование показало, что уровень IL-1β в эпителии зубодесневой бороздки у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом превысил контрольный почти в десять раз. (Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. № 1. С. 101–104.)

Ключевые слова: хронический генерализованный пародонтит, интерлейкин 1β, иммуноцитохимический метод.

Определение уровня интерлейкина 1β (IL-1β) в слизистой ротовой полости практически значимо для диагностики и выбора тактики лечения заболеваний пародонта [6]. Согласно имеющимся данным, содержание IL-1β можно определять иммуноферментным методом в слюне, десневой жидкости, с помощью иммунофлуоресценции, а также иммуногистохимическим методом — в срезах ткани десны [1, 2, 4, 5, 7, 9, 11]. Индукцию синтеза IL-1β (по экспрессии мРНК) можно также оценивать методом обратной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) [13]. Наряду с перечисленными методами определение IL-1β в ротовой полости возможно проводить иммуноцитохимическим методом в мазках-соскобах с поверхности зубодесневой бороздки. Этот метод, будучи неинвазивным и не требующим срочной пробоподготовки, мог бы найти практическое диагностическое применение в пародонтологии.

В связи с вышеизложенным, целью работы стало иммуноцитохимическое исследование IL-1β в мазках-соскобах с поверхности зубодесневой бороздки у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом и у лиц без заболевания пародонта.

Материалы и методы

Для выполнения исследования изначально был использован целенаправленный отбор больных, проходивших лечение в клинике ФГУЗ ВЦРЭМ им А.М. Никифорова МЧС России, в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ и в территориальном медицинском объединении № 54 (Санкт-Петербург) в период с 2004 по 2009 г.

Иммуноцитохимические исследования IL-1β в эпителии зубодесневой бороздки проводили в двух группах пациентов. 1-ю группу составили 63 пациента (33 мужчины и 30 женщин в возрасте от 20 до 60 лет) с диагнозом хронический генерализованный пародонтит перед началом хирургического лечения, имевшие глубину десневого кармана более 4 мм, абсцедирующую форму пародонтита и 3-ю степень подвижности зубов. Для сравнения была сформирована 2-я, контрольная, группа, включавшая курсантов Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ без заболеваний пародонта (мужчины от 22 до 27 лет, n=24).

Мазки получали с поверхности зубодесневой бороздки с помощью стерильной одноразовой щетки для браш-биопсий. У пациентов 1-й группы забор материала проводили направленно из гиперемированных, патологически измененных участков. Материал наносили на обезжиренные предметные стекла тонким слоем (однократными прокатывающими, а не многократными трущими и мажущими движениями). В полученных таким образом цитологических мазках всегда присутствовали зубной налет и эпителий десен. Забор материала из ротовой полости проводили утром натощак до чистки зубов. У каждого пациента брали по 3–4 мазка. Иммуноцитохимическое исследование проводили одномоментно в обеих группах. Для этого накопленные в архиве фиксированные, но неокрашенные мазки еще раз фиксировали смесью спирт:ацетон в соотношении 1:1 в течение 10 мин и высушивали на воздухе. Для визуализации присутствия IL-1β в мазках использовали моноклональные мышиные антитела, произведенные ООО «Цитокин» (ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, Санкт-Петербург), любезно предоставленные проф. А.С. Симбирцевым.

После повторной дофиксации и высушивания с помощью гидрофобного карандаша и круглого лекала ограничивали ареал диаметром 1 см, внутри которого и проводилось окрашивание.

Эндогенную пероксидазу в мазках инактивировали раствором 1 % азида натрия (Merck) в течение 10 мин, затем промывали в двух сменах бидистиллированной воды и оставляли на 5 мин в Трис-NaCl буфере (pH 7,6). Растворы первых антител вносили микродозатором в объеме по 50 мкл, в область, обведенную гидрофобным карандашом, и распределяли тонким слоем по ее поверхности.Концентрация рабочего раствора первых антител соответствовала 0,01 мг/мл, а инкубация с первыми антителами к IL-1β длилась в течение 30 мин при 37 °С.

После мечения первыми антителами препараты промывали в двух сменах буфера по 5 мин и наносили лошадиные анти-мышиные/анти-кроличьи биотинилированные антитела (R.T.U. Vectastain Universal ABC kit). Со вторыми антителами препараты инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Перед проявкой субстратом препараты промывали в буфере 1 ч.

Завершающим этапом иммуноцитохимического окрашивания на IL-1β было нанесение (на 3 мин при комнатной температуре) системы визуализации, состоящей из растворимого комплекса: авидина и биотинилированной пероксидазы хрена (R.T.U. Vectastain Universal ABC kit). Для проявки использовали 3,3-диаминобензидин (ДАБ) (DakoCytomation). Препараты докрашивали гематоксилином Майера.

Для количественной оценки результатов иммуноцитохимического выявления IL-1β применяли морфометрический метод. Для этого сначала получали цифровые снимки на малом увеличении с использованием объектива (×20, Leica DM 4000 В) при одинаковой интенсивности проходящего света и настройке конденсора. Затем полученный фотоархив использовали для количественной оценки содержания IL-1β в мазках (пластах эпителиоцитов) морфометрическим методом путем измерения оптической плотности в условных единицах. Для этого использовали систему компьютерного анализа микроскопических изображений Leica DFC 320 R2 и лицензионную программу ВидеоТест Морфология 4.0.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление