Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2012, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2012

Влияние муропептидов, содержащих остаток мезо-диаминопимелиновой кислоты, на макрофаги и дендритные клетки человека

М.В. Пащенков, С.Ф. Попилюк, Б.И. Алхазова, В.Л. Львов, В.В. Муругин, Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин

Муропептиды — низкомолекулярные фрагменты бактериального пептидогликана (ПГ) — являются мощными активаторами врожденной иммунной системы, однако их эффекты на антигенпредставляющие клетки (АПК) человека, в частности, на дендритные клетки (ДК) и макрофаги (МФ) охарактеризованы недостаточно. При лизоцимном гидролизе ПГ грамотрицательного микроорганизма Salmonella typhi образуются три основных муропептидных фрагмента: 1) β-N-ацетIL-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетIL-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновая кислота (ГМтри); 2) β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин (ГМтетра) и 3) димер ГМтетра (диГМтетра), в котором мономерные остатки ГМтетра соединены амидной связью между карбоксильной группой терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ω-аминогруппой мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка ГМтетра. В работе показано, что все три муропептида индуцируют выработку провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-1β макрофагами (ГМтри > ГМтетра > диГМтетра). При воздействии на незрелые ДК муропептиды не индуцируют выработку этих цитокинов, но вызывают созревание ДК (ГМтри > ГМтетра >> диГМтетра), а также продукцию ряда хемокинов. Таким образом, два типа АПК — МФ и ДК — принципиально по-разному отвечают на стимуляцию муропептидами. Ни ДК, ни МФ, стимулированные муропептидами, не вырабатывают Th1- и Th17-поляризующие цитокины IL-12p70 и IL-23, в результате чего эти АПК, вероятно, будут вызывать преимущественно Th2-ответ. ГМтетра по силе эффектов на АПК сопоставим с ГМтри и значительно превосходит диГМтетра, что позволяет рассматривать ГМтетра как перспективный иммуномодулятор. (Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. № 1. С. 33–41.)

Ключевые слова: муропептиды, макрофаги (МФ), дендритные клетки (ДК), цитокины, хемокины.

Бактериальный пептидогликан (ПГ) — один из наиболее мощных активаторов врожденной иммунной системы млекопитающих. Иммуностимулирующие свойства полимерного ПГ до конца не доказаны, однако мономерные фрагменты гидролиза ПГ — муропептиды — активируют клетки иммунной системы путем взаимодействия с рецепторами NOD1 и NOD2, находящимися в клеточном цитозоле [4, 6, 9, 10, 24]. Сигнальные пути от этих рецепторов индуцируют экспрессию генов врожденного иммунного ответа, в частности, провоспалительных цитокинов и антимикробных пептидов [14].

Муропептиды состоят из углеводной и пептидной частей. Первая из них может быть образована либо единственным остатком N-ацетил-D-мурамовой кислоты (М), либо дисахаридом — β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамовой кислотой (ГМ). Пептидная часть ковалентно связана с остатком М и состоит минимум из 2 аминокислотных остатков.

Муропептиды являются перспективными иммуномодуляторами и адъювантами, что обусловлено определенностью их химического состава, относительной простотой производства и воспроизводимым иммуностимулирующим эффектом in vivo [5, 8, 25–27]. Поэтому была проведена значительная работа по идентификации оптимальной химической структуры агонистов NOD1 и NOD2. Показано, что NOD1 распознает муропептиды с концевым остатком мезо-диаминопимелиновой кислоты (мезо-ДАП), которые образуются, в основном, при расщеплении ПГ грамотрицательных бактерий. Из исследованных агонистов NOD1 наиболее мощными являются мурамилтрипептид М–L-Ala–D-isoGln–мезо-ДАП (Мтри) и глюкозаминилмурамилтрипептид ГМ–L-Ala–D-isoGln–мезо-ДАП (ГМтри). Минимальный по размеру активный агонист NOD1 — дипептид D-isoGln–мезо-ДАП [4, 11]. Рецептор NOD2 распознает мурамилдипептид M–L-Ala–D-isoGln (МДП) и глюкозаминилмурамилтрипептид ГМ–L-Ala–D-isoGln (ГМДП или ГМди). Эти муропептиды являются структурными компонентами ПГ как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий [10, 11, 17].

Целью вышеописанных работ было найти наименьшие по размеру активные агонисты NOD1 или NOD2. Пептидный компонент в использованных агонистах состоял из 2–3 аминокислотных остатков. Однако в нативном ПГ пептидные цепи, как правило, длиннее. Более того, пептиды, отходящие от соседних гликановых цепей, образуют друг с другом ковалентные связи, поэтому при гидролизе естественного ПГ, катализируемом лизоцимом, могут образовываться димерные муропептиды, в которых два ГМ-дисахарида соединены мостиком, состоящим из 8 и более аминокислотных остатков. Такие «длинные» муропептиды в низких концентрациях не активируют NOD-рецепторы в модельных клетках — клетках HEK293T, трансгенно экспрессирующих NOD1 или NOD2 [9, 11]. Однако информация об их влиянии на естественные клетки иммунной системы практически отсутствует.

Основной целью настоящей работы было охарактеризовать эффекты «длинных» муропептидов, содержащих остаток мезо-ДАП, на клетки врожденной иммунной системы in vitro. В качестве «длинных» муропептидов использовали ГМ–L-Ala–D-isoGln–мезо-ДАП–D-Ala (ГМтетра) и димер ГМтетра (диГМтетра), в котором мономерные остатки ГМтетра соединены амидной связью между карбоксильной группой терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ω-аминогруппой мезо-ДАП другого остатка ГМтетра. Муропептиды, содержащие группировку ГМ, далее обобщенно называются ГМ-пептидами. В качестве препаратов сравнения использовали хорошо охарактеризованные агонисты NOD1 и NOD2 (соответственно, ГМтри и ГМди), а также классический активатор клеток врожденной иммунной системы — липополисахарид (ЛПС). В качестве модельных клеток использовали макрофаги (МФ) и миелоидные дендритные клетки (ДК) — два типа антигенпредставляющих клеток (АПК), являющихся ключевыми мишенями иммуностимуляторов и адъювантов [2, 12].

Второй задачей было изучение эффектов лактоилпроизводных ГМ-пептидов (лактоилпептидов), в которых группировка ГМ путем щелочной обработки заменена на остаток молочной кислоты.

Третьей задачей было сравнение эффектов муропептидов на незрелые ДК и на МФ.

Материалы и методы

1. Активные вещества и их получение

Первичную очистку ПГ S. typhi от белка, нуклеиновых кислот и липидов осуществляли путем трех последовательных обработок бактериальной биомассы 45 % водным фенолом (70 °C, 30 мин). Осадок ПГ тщательно отмывали, 5 г осадка ресуспендировали в 100 мл 0,2 M триэтиламмоний-ацетатного буфера (pH 7,2) и обрабатывали 0,3 % лизоцимом (Sigma, США) в течение 18 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь диализировали в течение 72 ч против того же буфера через мембрану с размером отсечки 5 кДа (Millipore, США), с пятикратной сменой буфера. Смесь низкомолекулярных фрагментов ПГ выделяли из объединенного диализата путем гель-хроматографии на колонке с Sephadex G-50 (Sigma), с элюцией 0,2 M хлоридом натрия, и далее обессоливали деионизированной апирогенной водой на колонке TSK-40 (Tosoh Bioscience, Германия). Элюат содержал три основных компонента — ГМтри, ГМтетра и диГМтетра, которые изолировали в виде смесей α- и β-аномеров путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке Zorbax ODS (9,4 мм × 25 см; Agilent Technologies, США) в градиенте вода:40 % водный ацетонитрил, с элюцией 0,1 % трифторуксусной кислотой. Лактоилпептиды ЛАКтри, ЛАКтетра и диЛАКтетра получали путем обработки, соответственно, ГМтри, ГМтетра и диГМтетра 4 М гидроксидом аммония при 37 °С в течение 5 ч (щелочная β-элиминация) и очищали с помощью ВЭЖХ в описанных выше условиях [11]. Чистоту всех веществ подтверждали путем аналитической ВЭЖХ, молекулярные массы верифицировали с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF, молекулярные структуры подтверждали с помощью 13С-ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии. ГМди был закуплен у Sigma. По данным LAL-теста (EndoSafe KTA, Charles River Laboratories, США), уровень эндотоксина во всех препаратах был менее чем 0,01 эндотоксиновой единицы (ЭЕ) на 1 мкг; контрольный ЛПС содержал 16000 ЭЕ/мкг.

2. Культивирование и стимуляция дендритных клеток и макрофагов

МФ и незрелые ДК получали из моноцитов здоровых доноров путем 6-суточного культивирования, соответственно, с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) и GM-CSF в сочетании с IL-4 [1, 22]. МФ и ДК, полученные на 6-е сутки, отмывали, помещали в 96-луночные плоскодонные планшеты (Nunc, Дания) в количестве 8×104 клеток на лунку и культивировали 24 ч либо без стимуляторов, либо в присутствии ГМ- и лактоилпептидов в конечных концентрациях 0,1—10 мкг/мл, либо в присутствии ЛПС E. coli O111:B4 (конечная концентрация 0,1 мкг/мл; Sigma). Через 24 ч собирали супернатанты и замораживали их при -70 °С.

3. Определение цитокинов и хемокинов в культуральных супернатантах

Концентрации цитокинов определяли иммуноферментным методом. IFNα, IL-1β, IL-6, IL-10 и TNFα определяли с помощью наборов реактивов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург), трансформирующий ростовой фактор β (TGFβ), IL-12p70 и IL-23 — с помощью наборов фирм, соответственно, Biosource/Invitrogen (Великобритания), BD Pharmingen (США) и Bender Medsystems (Австрия). Уровни хемокинов IL-8, эотаксина, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β и RANTES определяли методом мультиплексного анализа с помощью реактивов фирмы Bio-Rad (США) и прибора Bio-Plex 200 той же фирмы.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание и проточная цитометрия

МФ и незрелые ДК, полученные на 6-е сутки культивирования с GM-CSF и GM-CSF+IL-4, культивировали в 24-луночных планшетах (2,5×105 клеток на лунку) с ЛПС и ГМ-пептидами или без них. Через 24 ч клетки отмывали и окрашивали FITC-меченными моноклональными антителами (МАТ) к HLA-DR и CD83, PE-меченными МАТ к CD80 и PE-Cy5-меченными МАТ к CD86 (BD Pharmingen). Дополнительные образцы клеток окрашивали контрольными иммуноглобулинами тех же изотипов, что и МАТ (изотип-контроль). Окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 с использованием программы CXP (Beckman Coulter, США). Экспрессию каждого маркера измеряли как геометрическое среднее интенсивности флуоресценции (СИФ) по данному маркеру, за вычетом СИФ, полученной в изотип-контроле. Чтобы минимизировать вариабельность, все данные выражали как отношение СИФ стимулированных клеток к СИФ нестимулированных клеток, умноженное на 100%.

5. Смешанная лейкоцитарная реакция (СЛР)

6-суточные незрелые ДК культивировали в течение 24 ч либо без стимуляторов, либо с ГМтри (10 мкг/мл), либо с ЛПС (100 нг/мл), после чего трехкратно отмывали. Из суспензий аллогенных мононуклеарных клеток выделяли наивные CD4+ T-клетки (чистота >95 % по процентному содержанию CD4+CD45RA+ клеток; использовали реактивы и оборудование для иммуномагнитной сепарации клеток фирмы Miltenyi Biotec, Германия). Выделенные наивные CD4+ T-клетки культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах (2,5×104 на лунку) совместно с ДК в соотношениях ДК:Т 1:10, 1:100 и 1:1000; каждую культуру ставили в триплете. Спустя 96 ч во все лунки добавляли [3H]-5-метилтимидин (0,5 мкКи/лунку), и еще через 16 ч измеряли включение радиоактивной метки с помощью жидкостного сцинтилляционного β-счетчика. Отрицательными контролями служили культуры, содержащие только наивные CD4+ Т-клетки (2,5×104 на лунку) или только ЛПС-активированные ДК (2,5×103 на лунку).

6. Статистическая обработка данных

Использовали программу Statistica 6.0 (Statsoft Inc., США). Парные измерения сравнивали с помощью теста Вилкоксона, если не указано иное. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление