Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2012, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2012

Изучение иммуномодулирующих свойств N-концевого пептида растворимого фактора, ингибирующего иммунный ответ

А.В. Петров, Н.В. Пигарева, А.А. Колобов, А.С. Симбирцев

Растворимый фактор, подавляющий иммунный ответ (SIRS, soluble immune response suppressor) – неспецифический ингибитор иммунного ответа, описанный 35 лет назад как фактор, появляющийся в супернатантах первичных культур спленоцитов мыши, инкубированных с конканавалином А. Впоследствии был описан N-концевой пептид этого фактора (SIRS1-21), сохраняющий его активность. В данной работе с использованием современных методик изучены эффекты SIRS1-21 на клетки иммунной системы invitro. Оценивали влияние на митоген-индуцированную пролиферацию и продукцию цитокинов спленоцитами мыши, антителообразование invitro, проявление биологической активности рекомбинантных цитокинов. Показано, что SIRS1-21 подавляет продукцию спленоцитами IL-1α, IL-6, TNFα и IL-17 при умеренной стимуляции продукции IL-2, а также выражено ингибирует IL-1-зависимую пролиферацию тимоцитов в комитогенном тесте при минимальном эффекте на рост IL-1-зависимой линии D10.G4.1. (Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. № 2. С. 90–95.)

Ключевые слова: растворимый фактор, подавляющий иммунный ответ, цитокины, иммуномодулирующие свойства, IL-1.

Иммунологические исследования 70–80-х годов XX века часто описывали различные «факторы», обладающие определенным спектром активностей и выделенные из биологических жидкостей или супернатантов клеток. Вслед за выявлением активности, как правило, следовали работы, в которых с помощью различных способов разделения биомолекул проводилась очистка «фактора», иногда до чистоты такой степени, которая позволяла бы выполнить идентификацию белковой структуры действующего начала. Кроме того, путем различных химических воздействий на обладающую активностью субстанцию, например, путем разрушения дисульфидных связей восстанавливающими агентами или ферментативного расщепления, удавалось сделать важные предсказания о структуре белковой молекулы. На основании белковой последовательности ученые нередко успешно создавали вырожденные олигонуклеотиды, а, используя их в качестве зондов при молекулярной гибридизации, выделяли и клонировали гены, кодирующие соответствующие белки.

Бурное развитие генетики и молекулярной биологии в последующие годы радикально изменило подходы и способы описания новых молекул, в частности, в иммунологии. Последовательность изучения «активность→белок→ген» сегодня практически исчезла и уступила место обратной последовательности: «ген→белок→активность». В современной иммунологии открытие новых молекул практически всегда происходит благодаря результатам анализа in silico, когда на основании гомологий нуклеотидных последовательностей обнаруживаются новые гены, предсказывается аминокислотная последовательность белков, создаваемых генно-инженерным путем, и уже затем исследуется их активность.

Интересно, что не всем описанным в свое время «факторам» было суждено стать идентифицированными белками. Иногда по разным причинам исследования не доводились до логического конца и, со временем потеряв актуальность, постепенно забывались. Примером подобной истории может быть так называемый «растворимый фактор, подавляющий иммунный ответ» (soluble immune response suppressor (SIRS)), неспецифический ингибитор иммунного ответа, описанный 35 лет назад.

В 1976 г. впервые было показано, что в супернатантах первичных культур спленоцитов мыши, инкубированных с конканавалином А (КонА) в течение 48 ч, появляется фактор, способный тормозить ответ на эритроциты барана в реакции розеткообразования [12]. Это вещество и получило название «растворимого фактора, подавляющего иммунный ответ». Было показано, что точкой приложения действия SIRS являются макрофаги, поскольку инкубация перитонеальных макрофагов с SIRS блокировала антигенный ответ спленоцитов, а обработка спленоцитов SIRS не влияла на их ответ на антигенный стимул. В ходе дальнейших исследований оказалось, что это полипептид с молекулярной массой около 10–14 кДа, продуцируемый CD8+-клетками, активированными митогенами, антигеном или интерферонами, который обладает способностью ингибировать продукцию антител и угнетать реакцию гиперчувствительности замедленного типа invivo [2].

Методом изоэлектрического фокусирования были выделены три изоформы SIRS мыши при pH 7, 6 и 5, которые были названы SIRS-a7, SIRS-a6 и SIRS-a5, соответственно. Установлена первичная последовательность N-концевого фрагмента SIRS-a7, состоящего из 21 аминокислотного остатка (SIRS1-21). На момент описания оказалось, что последовательность SIRS1-21 уникальна для млекопитающих, но имеет высокую степень гомологии с семейством коротких нейротоксинов змей [13]. Также было показано, что антисыворотки, полученные к указанному пептиду, блокируют активность нативного фактора [5].

В опытах invitro было показано, что SIRS ингибирует действие интерлейкина (IL)-1 [15]. В свою очередь, цитокины IL-1, IL-2, а также фактор роста эпителия способны отменять эффекты SIRS [1]. В экспериментах на мышах было установлено, что внутривенное введение SIRS вызывает дозозависимое угнетение лейкоцитоза, индуцируемого IL-1. SIRS также действует как апироген: даже однократное его введение кроликам отменяло повышение температуры тела после внутривенных инъекций бактериального эндотоксина, причем эта активность у SIRS гораздо более выражена, чем у ацетилсалициловой кислоты [14]. На момент исследований было высказано предположение, что SIRS является ингибитором действия IL-1, снижая чувствительность клеток к активирующим сигналам данного цитокина.

В 1990-е гг. активные исследования природы SIRS были прекращены, по всей видимости, ввиду безуспешности попыток установления аминокислотной последовательности целого белка [9]. Однако в 2007–2008 гг. группа авторов продемонстрировала терапевтическую активность пептидного фрагмента SIRS1-21 на животных в моделях экспериментального аллергического энцефаломиелита и сахарного диабета 1-го типа [3, 4]. Поскольку в данном случае речь идет не о гипотетическом факторе неизвестной природы, а о коротком полипептиде с определенной структурой, мы заинтересовались этим веществом и провели исследование биологической активности пептида SIRS1-21 с использованием широкого круга иммунологических тестов invitro, чтобы оценить его иммунотерапевтический потенциал.

Материалы и методы

Синтез пептида SIRS1-21 (H-Met-Thr-Glu-Glu-Asn-Gln-Gln-Ser-Ser-Gln-Pro-Lys-Thr-Thr-Ile-Asn-Asn-Ala-Gly-Asp-Ser-OH) проводили твердофазным способом на синтезаторе Vega Coupler 250 по методу insitu c использованием Nα-Boc-защищенных производных аминокислот. Выделенный грубый продукт подвергался очистке методом полупрепаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ. Фракцию, соответствующую пику основного продукта, после лиофильной сушки подвергали масс-спектральному и ВЭЖХ-анализам. По данным MALDI-TOF-спектрометрии, молекулярная масса пептида (М+Н)+ составила 2281 Да (теоретическая молекулярная масса в расчете на свободный пептид — 2280,38 Да). Содержание основного вещества пептида SIRS1-21, по данным ВЭЖХ, составляло более 95 %.

В экспериментах использовали культуральную среду RPMI-1640 (Sigma) с добавлением 2 мМ глутамина, 40 мг/л гентамицина и 50 мкм 2-меркаптоэтанола. Культивирование клеток проводили с добавлением телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС) (HyClone) как указано ниже. Для стимуляции клеток использовали митогены: КонА, митоген лаконоса (МЛ), липополисахарид (ЛПС) из E coli 055:B5 (все из Sigma). Культивирование клеток проводили в культуральных платах и флаконах производства Сorning Inc.

Первичные культуры спленоцитов и тимоцитов получали от мышей (CBA×C57Bl/6)F1 (питомник «Рапполово»). Мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации. Тимусы и селезенки брали асептически, измельчали ножницами, фильтровали суспензию через два слоя стерильной марли, дважды отмывали забуференным фосфатным физиологическим раствором (ЗФР) (в суспензии спленоцитов предварительно лизировали эритроциты 0,83 % раствором хлорида аммония), ресуспендировали клетки в среде RPMI-1640, подсчитывали клеточность в камере Горяева.

Для оценки влияния на пролиферацию спленоцитов при стимуляции митогенамипептид SIRS1-21 разводили в среде RPMI-1640 с 1 % ТЭС в концентрации 1 мг/мл, далее готовили последовательные разведения и вносили в лунки 96-луночной плоскодонной платы по 50 мкл на лунку. Затем в лунки вносили стерильные растворы митогенов также по 50 мкл на лунку и добавляли суспензию спленоцитов в 100 мкл среды RPMI-1640 по 3×105 клеток на лунку с ТЭС (конечная концентрация 10 %). Платы инкубировали в CO2-инкубаторе при 37 °С в условиях абсолютной влажности. Через 48 ч от начала инкубации в культуры клеток вносили 5-метил-3Н-тимидин («Изотоп», Санкт-Петербург) в конечной концентрации 5 мкКи/мл. Через сутки клетки переносили на стекловолоконные фильтры с помощью харвестера FilterMate 96 (Perkin-Elmer) и определяли интенсивность включения тимидина на плашечном β-счетчике MicroBeta TriLux 1450 (Perkin-Elmer). Результаты выражали в количестве импульсов в минуту (имп/мин).

Для оценки влияния на продукцию цитокинов в культурах спленоцитов клеткиинкубировали с различными концентрациями пептида SIRS1-21 в присутствии 2 мкг/мл КонА или 5 мкг/мл МЛ в течение 72 ч. Инкубацию проводили в 96-луночных плоскодонных платах при плотности культуры 1×106 клеток на лунку в 200 мкл среды RPMI-1640 с 5 % ТЭС в двух параллелях. В конце инкубации супернатанты отбирали и замораживали при –20 °С до проведения анализа содержания цитокинов. В полученных супернатантах определяли концентрации цитокинов и хемокинов (IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, MCP-1, MIP-1α, IFNγ, TNFα) с помощью коммерческих наборов FlowCytomix производства Bender MedSystems в соответствии с инструкцией изготовителя на проточном цитофлуориметре EPICS XL (Beckman Coulter). Анализ результатов (построение калибровочных кривых и расчет концентраций цитокинов в исследованных образцах) проводили с помощью программы FlowCytomix Pro2.3 (Bender MedSystems).

Анализ уровней IgM в супернатантах спленоцитов, стимулированных МЛ на фоне различных доз SIRS1-21 в течение 5 суток, как описано выше, проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве захватывающих антител использовали биотинилированные антитела к IgM мыши (eBioscience). В платы с сорбированными антителами вносили последовательные разведения исследуемых супернатантов. Для детекции использовали козьи антитела к IgM мыши, меченые пероксидазой хрена (Sigma), в разведении, рекомендованном производителем. Окраску проводили с помощью однокомпонентного раствора ТМБ («Хема», Санкт-Петербург). Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М серной кислоты и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм на планшетном счетчике Victor2 (Wallac). Титры определяли как теоретическое разведение образца, при котором оптическая плотность за вычетом фона составляет 0,1. Расчет титров проводили с помощью степенной аппроксимации в программе Microsoft Excel 2003.

Анализ экспрессии поверхностных иммуноглобулинов на В клетках послеинкубации суспензии спленоцитов с различными дозами исследуемого пептида и МЛ в течение 3 или 5 суток проводили с помощью проточного цитофлуориметра EPICS XL (Beckman Coulter). Клетки окрашивали моноклональными антителами анти-CD19-PE и анти-IgM-биотин с докрашиванием конъюгатом стрептавидин-FITC.

Влияние пептида SIRS1-21 на биологическую активность TNFαизучали в цитотоксическом тесте на линии фибробластов L-929 [7].

Для определения влияния пептида SIRS1-21 на биологическую активность IL-1β использовали комитогенный тест с тимоцитами мышей, а также IL-1-зависимую линию D10.G4.1.

Тимоциты выделяли как описано выше и инкубировали в полной среде с 2 % ТЭС в 96-луночной плоскодонной культуральной плате по 1×106 клеток на лунку в присутствии последовательных разведений исследуемого пептида на фоне различных концентраций рекомбинантного IL-1β человека (ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России) и субоптимальной концентрации КонА, определенной в предварительных экспериментах. Через двое суток инкубации в культуры клеток вносили 3Н-тимидин. Через сутки клетки переносили на стекловолоконные фильтры и определяли интенсивность включения тимидина. Результаты выражали в количестве импульсов в минуту.

Клетки IL-1-зависимой линии D10.G4.1 через 2 суток после пересева отмывали, вносили в 96-луночный плоскодонный культуральный планшет по 2×104 клеток на лунку в полной среде с 10 % ТЭС и инкубировали в присутствии последовательных разведений исследуемого пептида на фоне IL-1β и 2 мкг/мл КонА. Через 3 суток в культуры клеток вносили 3Н-меченный тимидин на 6 ч и затем клетки переносили на стекловолоконные фильтры, и определяли интенсивность включения тимидина.

Статистический анализ: результаты измерений, полученные в параллелях, усредняли и приводили в таблицах среднее значение и стандартное отклонение; достоверность различий определяли с помощью t-теста Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление