Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2012, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2012

Биологическая активность обогащенных пролином защитных пептидов системы врожденного иммунитета

Е.В. Ямщикова, Д.С. Орлов, Н.И. Колодкин, М.С. Жаркова, Т.Ю.Пазина, Г.А. Сакута, А.С. Трулев, В.Н. Кокряков, О.В. Шамова

Антимикробные пептиды (АМП) являются ключевыми эффекторными молекулами системы врожденного иммунитета человека и животных. Обогащенные пролином антимикробные пептиды составляют особую группу АМП, представители которой имеют высокую антимикробную активность и низкую токсичность в отношении клеток млекопитающих, что позволяет рассматривать их, как перспективные объекты для разработки на их основе новых антибиотических лекарственных препаратов. Однако свойства АМП этой группы остаются малоизученными. В работе представлены данные сравнительного изучения биологической активности двух природных обогащенных пролином пептидов (ОПП) из семейства бактенецинов — ChBac3.4 и ChBac5, открытых нами ранее в нейтрофильных гранулоцитах козы. Несмотря на значительное структурное сходство, биологическая активность этих пептидов различалась. В то время как ChBac5 демонстрировал свойства, типичные для ОПП (антимиробное действие его не сопровождалось значительным повреждением мембран бактерий, он имел низкую токсичность в отношении клеток человека), другой пептид ChBac3.4 вызывал значительно более выраженное увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны E.coli ML35p, а также, в отличие от ChBac5, обладал токсичностью в отношении ряда линий опухолевых клеток в культуре. Эти раличия, возможно, объясняются большей гидрофобностью молекулы ChBac3.4 по сравнению с ChBac5, а также отсутствием у него конформации полипролиновой спирали, характерной для большинства ОПП. В работе также показано, что оба пептида обладают сходной липополисахарид-связывающей активностью, не проявляют гемолитических свойств в отношении эритроцитов человека. Кроме того, ChBac5, но не ChBac3.4, проявлял стимулирующее действие на пролиферацию фибробластов человека. Проведенные исследования дают важную информацию для определения направления дальнейшего детального структурно-функционального анализа, который позволит реализовать разработку на основе этих пептидов новых антибиотических лекарственных препаратов. (Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. № 2. С. 100–106.)

Ключевые слова: антимикробные пептиды, бактенецины, Bac3.

Быстродействующая защита от патогенных микроорганизмов у человека и животных обеспечивается системой врожденного иммунитета в ходе реакций воспаления, фагоцитоза, секреции слизи эпителиями барьерных органов. Молекулярной основой системы врожденного иммунитета служит комплекс веществ, распознающих патогены и реализующих их элиминацию; среди них важную роль играют катионные антимикробные пептиды (АМП), содержащиеся в нейтрофилах, моноцитах/макрофагах, клетках барьерных эпителиев. АМП обладают различной первичной структурой и конформацией молекул, представляя несколько структурных классов; и отличаются по спектру антимикробной активности и механизмам действия на микроорганизмы. Селективность антимикробного действия, отсутствие у микроорганизмов резистентности обусловили интенсивное изучение данной группы биологических веществ с целью создания антибиотиков нового поколения. Наряду с антибиотическими свойствами, АМП проявляют разнообразные эффекты в отношении и собственных клеток организма. В низких концентрациях (нМ) некоторые из них вызывают хемотаксис макрофагов, нейтрофилов, незрелых дендритных клеток; дегрануляцию тучных клеток; влияют на функциональную активность и метаболизм тромбоцитов, связывают бактериальный липополисахарид; влияют на процессинг IL-1β; ингибируют индуцированный АКТГ стероидогенез в клетках коркового слоя надпочечников [1, 2]. В концентрациях, превышающих антимикробные, большинство АМП токсичны и для эукариотических клеток.

Одним из структурных классов АМП являются обогащенные пролином пептиды (ОПП) (prolin-rich peptides (PRP)). Эти пептиды были обнаружены у животных различных таксономических групп — от беспозвоночных до млекопитающих. У млекопитающих ОПП наиболее распространены у животных отряда парнокопытных, где эти пептиды являются количественно доминирующим классом АМП. ОПП млекопитающих интересны тем, что имеют двоякий механизм антимикробного действия: в низких концентрациях (близких к минимальным ингибирующим рост бактерий концентрациям) они проникают в бактериальные клетки и нарушают внутриклеточные процессы, в частности, блокируют фолдинг белков, связываясь с белком-шапероном DnaK [11]; в более высоких концентрациях повреждают бактериальные мембраны [10]. При этом описанные в литературе ОПП отличаются селективым антимикробным действием в отношении грамотрицательных бактерий, а также низкой токсичностью для клеток млекопитающих.

Учитывая, что ОПП в настоящее время рассматриваются как перспективная основа для создания новых антибиотических и иммуномодулирующих лекарственных препаратов, детальное изучение биологических свойств различных представителей этого структурного класса пептидов является актуальной задачей экспериментальной медицины.

Объектами данной работы явились два ОПП, обнаруженные нами ранее в лейкоцитах домашней козы (Caprahirca) и названные ChBac5 и ChBac3.4 [12, 13]. Несмотря на значительное структурное сходство, аминокислотные последовательности этих пептидов отличались тем, что в структуре ChBac5 имелось девять повторяющихся последовательностей из трех аминокислот (наличие повторяющихся участков характерно для ОПП), в то время как в молекуле ChBac3.4 присутствовали лишь три таких мотива. Как было показано, биологические свойства этих пептидов различаются: ChBac3.4 имел значительно более высокую активность в отношении грамположительных бактерий, чем ChBac5 и большинство других известных ОПП [13].

Сравнительный анализ биологической активности и особенностей структуры ChBac3.4 и ChBac5 явился основной целью данной работы. В задачи работы входило исследование действия пептидов на бактериальные клетки (влияние на проницаемость мембран, способность связываться с бактериальным липополисахаридом), а также их эффектов в отношении эукариотических клеток (токсичность для опухолевых и нормальных клеток млекопитающих, влияние на пролиферацию фибробластов кожи человека); кроме того, проводилось сравнение структур пептидов с использованием молекулярного моделирования.

Материалы и методы

Антимикробные пептиды: В работе использовали химически синтезированные ChBac3.4 и ChBac5, полученные последовательным наращиванием пептидной цепи на р-метилбензгидриламинополимере (Sigma, USA) на синтезаторе Vega Coupler 250 (США) с помощью оксибензотриазоловых эфиров и нейтрализацией in situ, с использованием Boc-технологии [8]. Очистку пептидов проводили с помощью обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Чистота полученных бактенецинов была более 99%. Они были индивидуальны по данным аналитической ВЭЖХ и аминокислотного анализа, а их молекулярные массы по данным масс-спектрометрии соответствовали расчетным.

Оценка проницаемости цитоплазматической мембраны бактерий. Принцип метода и особенности штамма E. coli ML35p описаны ранее [7]. О состоянии цитоплазматической мембраны E. coli ML35p судили по ее проницаемости для хромогенного маркера о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (ONPG), являющегося субстратом для фермента β-галактозидазы, а также для продукта этой ферментативной реакции. Используемый в данном методе штамм E. coli ML35pотличаетсяотсутствием пермеазы лактозы (фермента, осуществляющего транспорт лактозы в клетку), причем синтез β-галактозидазы в цитоплазме этой бактерии не индуцибельный, как у большинства бактерий, а конститутивный. При наличии в среде, окружающей бактерию, субстрата для β-галактозидазы, ферментативная реакция с участием этого субстрата может происходить только в том случае, если он способен проникать через мембраны бактерии, то есть пока целостность мембран бактерий не нарушена, реакция не протекает. Если же под действием какого-либо повреждающего агента, например антимикробного пептида, цитоплазматическая (и также наружная) мембрана бактерии становится проницаемой для ONPG, хромогенный продукт его гидролиза внутриклеточным ферментом выходит в инкубационную среду. Оптическая плотность среды при длине волны 420 нм (максимум поглощения хромогенного продукта) увеличивается, что позволяет наблюдать за процессом повреждения внутренней мембраны бактерии под действием антимикробного агента в режиме реального времени. Состав проб (100 мкл): 2,5 мМ ONPG (Sigma, USA); 2,5 × 107 КОЕ/мл бактерии; 0,01 М Na-фосфатный буфер рН 7,4 с 100 mM NaCl; 0,03% триптический гидролизат сои; пептиды в различных концентрациях. Пептиды разводили в 0,01% уксусной кислоте. Контрольные пробы содержали вместо препаратов равные объемы 0,01% раствора уксусной кислоты. Пробы вносили в лунки 96-луночного планшета и проводили измерение оптической плотности раствора при длине волны 420 нм с помощью спектрофотометра SpectraMax 250 фирмы Molecular Devices при температуре 37 ºС и периодическом встряхивании планшетов в течении двух часов. Данные обрабатывали в программе Sigma Plot 9.

Липополисахарид-связывающую активность пептидов изучали с помощью количественного хромогенного Лимулюс теста (quantitative chromogenic limulus amebocyte lysate (LAL); Lonza Walkersvile, USA). При проведении экспериментов и обработке полученных результатов использовали методы и подходы, описанные в статье Turner J. и др. [14]. Приготавливали серийные двукратные разведения пептидов в воде с 0,01% уксусной кислоты; и инкубировали пептиды с липополисахаридом E. coli O111:B4 в конечной концентрации 0,5 ЕД/мл в течение 30 мин при 37 ºС в планшетах Costar 3596 (Corning, USA). Далее проводили количественное определение свободного ЛПС в соответствии с рекомендациями производителя набора. Планшет помещали в термостатируемую камеру спектрофотометра SpectraMax 250 (Molecular Devices, USA), инубировали его при 37 ºС, измеряя оптическую плотность раствора при 405 нм; вычисляли разницу величин оптической плотности в начале инкубации и через 10 мин — ∆OD405. Долю связанного ЛПС (в процентах) определяли по формуле:

% связанного ЛПС=α(ЛПС без пептида)–α(ЛПС с пептидом)/α(ЛПС без пептида), где α=∆OD405(пептид (или вода) с ЛПС)–∆OD405(пептид (или вода) без ЛПС).

Строили кривые зависимости доли связанного ЛПС (в %) от концентрации пептидов в инкубационной среде (программа Sigma Plot 9) и определяли ЭК50 (эффективная концентрация 50% или концентрация пептидов, при которой 50% ЛПС находится в связанном состоянии).

МТТ-тест проводили по стандартной методике [9]. Клетки монослойных культур высеивали в планшеты (по 10000 клеток на лунку) за 20 ч до внесения пептидов, чтобы позволить клеткам сформировать монослой, суспензионные клетки вносили непосредственно перед добавлением пептидов. Для построения графиков и расчета медианной ингибирующей концентрации пептидов (ИК50) применяли программу Sigma Plot 9. В работе использовали следующие клеточные линии: клетки эритромиелоидной лейкемии человека К-562, клетки гистиоцитарной лимфомы человека U-937, клетки промиелоцитарной лейкемии человека HL-60, а также нетрансформированные клетки: нормальные фибробласты кожи человека, нейтрофилы человека, фибробласты легкого эмбриона человека MRC-5. Нейтрофилы человека и другие первичные культуры клеток получали общепринятыми в клеточной биологии методами. Клетки суспензионных культур К-562, U-937, HL-60 культивировали в среде RPMI-1640, дополненной глутамином, гентамицином и 10 % эмбриональной телячьей сывороткой. Клетки, образующие монослой, культивировали в среде ДМЕМ, содержащей те же добавки. При оценке токсичности пептидов инкубацию их с клетками проводили в течение 20 ч при 37 ºС в атмосфере 5 % СО2, при изучении влияния пептидов на пролиферацию фибробластов кожи человека инкубацию вели в течение 72 ч.

При проведении статистической обработки подсчитывали среднее значение и среднеквадратичное отклонение. Группы сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента.

Молекулярное моделирование. Гидрофобные свойста пептидов были оценены с помощью расчета разности свободных энергий в воде и в среде, моделирующей мембрану (н-октаноле) с использованием программы Matlab. Удельные разности свободных энергий для аминокислот с учетом пептидной связи взяты из работы Wimley и White [15]. Расчеты молекулярной динамики длительностью 50 нс в воде с ионами Na+ и Cl- выполнены в пакете Gromacs-4.5.4 с использованием полноатомного силового поля Gromos43a2 [6]. Компьютерная модель начальной альфа-спиральной конформации была создана в пакете PyMol, Shrödinger Inc. Работа проведена на оборудовании Лаборатории прикладной математики и механики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление