Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2012, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2012

Экспрессия негативного регулятора транскрипции генов белка SOCS1 в мононуклеарах периферической крови больных бронхиальной астмой

Л.Н. Сорокина, В.Н. Минеев, В.В. Лим, М.А. Нёма, В.И. Трофимов

Цель — изучить экспрессию регулятора транскрипции SOCS1 в мононуклеарах периферической крови (МНПК) больных бронхиальной астмой (БА). Обследовано 14 практически здоровых лиц и 73 больных БА: 40 с аллергической (АБА) и 33 с неаллергической (НАБА). Экспрессию мРНК SOCS1 оценивали путем проведения RT-PCR c нуклеиновыми кислотами, выделенными из МНПК. Праймеры для SOCS1 были разработаны на основе известных последовательностей (GenBank). Уровень экспрессии мРНК SOCS1 оценивали относительно уровня β-актина. Экспрессию белка SOCS1 оценивали в western blotting по отношению к уровню экспрессии β-актина, используя соответствующие антитела. У больных АБА выявлено значительное снижение (в 5,4 раза) уровня экспрессии белка-регулятора транскрипции генов SOCS1 в МНПК по сравнению с контрольной группой и группой больных НАБА (в 5,3 раза). При НАБА значимых различий по сравнению с контрольной группой не выявлено. При АБА отмечается выраженное снижение уровня экспрессии мРНК SOCS1 в МНПК по сравнению с контрольной группой (в 1,4 раза) и группой больных НАБА (в 1,3 раза). SOCS1 может играть важную роль в патогенезе БА. Снижение экспрессии негативного белка-регулятора SOCS1, а также уровня экспрессии мРНК SOCS1 у больных АБА может указывать на дефектность в системе негативной регуляции при АБА. (Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. № 2. С. 23–27.)

Ключевые слова: бронхиальная астма, система SOCS-белков, белок SOCS1, мононуклеары.

Ранее нами была рассмотрена новая сигнальная система Janus Kinases-Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK-STAT), включающая семейство супрессоровцитокиновой сигнализации Suppressors of cytokine signaling (SOCS-белков) и ее роль в патогенезе бронхиальной астмы (БА) [1–3]. В нестимулированных клетках негативные регуляторы транскрипции генов, как правило, характеризуются низким уровнем экспрессии, который быстро возрастает при цитокиновой стимуляции, приводя к последующему ингибированию JAK-STAT сигнальной системы с формированием классической петли отрицательной обратной связи [8, 11].

Данная статья посвящена одному из представителей семейства SOCS- белков, а именно белку SOCS1. В исследованиях последних лет было показано его важное место в патогенезе БА. Так, установлено, что SOCS1 с помощью IFNγ ингибирует IL-4, предотвращая одновременную активацию двух альтернативных сигнальных путей: IL-4 и IFNγ [10]. Повышенная экспрессия SOCS1 может приводить к угнетению IL-13-индуцированного иммунного ответа в дыхательных путях по механизму отрицательной обратной связи. С другой стороны, IL-4 и IL-13, активируя STAT6, могут одновременно индуцировать белки-регуляторы SOCS1 и SOCS3, приводя к угнетению IFNγ- и TNFα-сигнальных путей [5].

Целью данного исследования является изучение экспрессии регулятора транскрипции SOCS1 в мононуклеарах периферической крови (МНПК) больных аллергической (АБА) и неаллергической бронхиальной астмой (НБА).

Материалы и методы

Обследованы 14 практически здоровых лиц и 73 больных БА: 40 с АБА и 33 с НАБА. Все обследованные больные БА находились на лечении в клинике госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Всем больным проводили комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, включавшее общеклинические методы, цитологический и бактериологический анализ мокроты или промывных вод бронхов, а также, по показаниям, бронхоскопическое, аллергологическое и микологическое, гормональные исследования. В каждой обследованной группе проводили исследование функции внешнего дыхания.

Диагноз БА устанавливали в соответствии с классификацией и критериями международного консенсуса по вопросам диагностики и лечения БА (Global Initiative of Asthma (GINA), 2010).

Выделение мононуклеаров периферической крови. В качестве модели исследования во всех охарактеризованных ниже методиках выбраны МНПК. Не позднее чем через 40 мин после получения венозной крови проводили выделение мононуклеаров методом центрифугирования в градиенте плотности «Lymphoseparation Medium» (MP Biomedicals, USA), плотность 1,077 г/см3(Boyum A., 1968). Гепаринизированную кровь разводили в два раза раствором хлорида натрия (9 г/л, pH=7,2), наслаивали на 3 мл градиента плотности и центрифугировали 30 мин при 400 g. Образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеаров отбирали пипеткой, полученную клеточную взвесь трижды отмывали раствором хлорида натрия (9 г/л, pH=7,2) и доводили концентрацию до 2´106 клеток/мл. Жизнеспособность клеток, которую определяли по включению трипанового синего, составляла 95–100 %.

Исследование экспрессии мРНК SOCS1 методом RT-PCR. Работа выполнена на базе лаборатории Научно-методического центра по молекулярной медицине на базе СПбГМУ им. И.П. Павлова.

Экспрессию мРНК SOCS1 оценивали путем проведения Reverse Transcription (RT-PCR) c нуклеиновыми кислотами, выделенными из МНПК. ПЦР проводили в амплификаторе «iCycler» (Bio-Rad) в следующем режиме: инициация при 95 ºС в течение 4 мин, 30 циклов денатурации при 95 ºС в течение 30 с, отжиг при 60 ºС в течение 30 с и полимеризация при 70 ºС в течение 30 с. Завершающую полимеризацию проводили при 72 ºС в течение 7 мин. Продукт амплификации размером 339 п. о. подвергали электрофорезу в 1,5 % агарозном геле и окраске бромидом этидия. Праймеры для SOCS1 были разработаны на основе известных последовательностей (GenBank).

SOCS1 5': 5'-CTGGGATGCCGTGTTATTTT-3' и SOCS1 3': 5'-TAGGAGGTGCGAGTTCAGGT-3'.

β-актин -5': 5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3' и β-актин -3': 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'.

Результат электрофореза после фотографирования в ультрафиолетовом свете анализировали в программе Gel-Pro 3.1. Уровень экспрессии мРНК негативного регулятора транскрипции генов SOCS1 оценивали относительно уровня β-актина.

Исследование экспрессии белка SOCS1 методом иммуноблоттинга в мононуклеарах периферической крови больных бронхиальной астмой. Работа выполнена на базе отдела «Внутриклеточной сигнализации и транспорта» Научно-исследовательского института цитологии РАН.

После окончания выделения клеток мононуклеары помещали на лед, и все дальнейшие процедуры проводили при +4 °С. Клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS). Тотальный лизат получали добавлением в пробирки 0,1 мл лизирующего буфера (Lysis-buffer), содержащего PBS с добавлением 1 % Тритона Х-100, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4 и коктейля протеазных ингибиторов (Sigma, USA). Клетки инкубировали в течение 10 мин при +4 °С. Затем клеточный лизат центрифугировали 15 мин при 10000 g. К супернатанту добавляли 1/4 часть (от объема пробы) буфера для электрофоретических проб, содержащего 40 мМ Трис (рН 6,8), 10 % SDS, 20 % 2-меркаптоэтанола и 40 % глицерина, и инкубировали в течение 5 мин при +100 °С. Концентрацию белка определяли по методу Bradford, используя овальбумин для построения калибровочной кривой. Методикаэлектрофореза и иммуноблоттингаподробно описана ранее [2]. Хемилюминесцентное излучение регистрировали экспонированием на рентгеновскую пленку CEA RP NEW (CEA AB, Sweden).

Антитела. Окрашивание антителами проводили в соответствии со стандартными протоколами Bio-Rad Laboratories с использованием конъюгированных с пероксидазой хрена вторичных антител и реакции усиленной хемилюминесценции. Для специфического выявления белков использовали поликлональные анти-SOCS1 антитела (Santa Cruz Biotechnology, UK). Уровень белка определяли по уровню β-актина с использованием соответствующих моноклональных антител в разведении 1:20000 (Sigma Aldrich, USA). В качестве вторичных антител применяли козьи антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена, в разведении 1:10000 (GAR-HRP, Cell Signaling Technology, USA); козьи антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, в разведении 1:10000 (GAM-HRP, Sigma Aldrich, USA).

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью стандартного пакета прикладного статистического анализа SPSS для Windows (русифицированная версия 13.0). Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты оценки уровней экспрессии SOCS1 в обследованных группах представлены в табл. 1.

Таблица 1

Уровни экспрессии белка SOCS1 в обследованных группах (интегрированная плотность по отношению к β-актину)

Группа обследования

Значение*

Достоверность различий

1

Контрольная группа (практически здоровые лица), n=14

0,43 (0,21; 0,74)

1–2–3: p=0,029**

1–2: p=0,036***

1–3: p>0,05***

2–3: p=0,024***

2

Больные аллергической бронхиальной астмой, n=40

0,08 (0,022; 0,4)

3

Больные неаллергической бронхиальной астмой, n=33

0,42 (0,037; 0,69)

Примечание.* — при распределениях, отличающихся от нормального, указаны М (медиана) (25–75) процентили (непараметрическая статистика); ** — при распределениях, отличающихся от нормального, использован критерий Н независимых выборок Крускала — Уоллиса; *** — уровень значимости, определяющий достоверность различий (для сравнения двух независимых выборок использован U-критерий Манна — Уитни).

Очевидно, что у больных АБА выявлено значительное снижение уровня экспрессии белка-регулятора транскрипции генов SOCS1 в МНПК по сравнению с контрольной группой практически здоровых лиц (в 5,4 раза) и группой больных НАБА (в 5,3 раза). Аналогичные закономерности получены при анализе уровня экспрессии мРНК SOCS1 (табл. 2).

Таблица 2

Уровни экспрессии мРНК белка SOCS1 в обследованных группах (стандартизованы по уровню экспрессии мРНК β-актина)

Группа обследования

Значение*

Достоверность

различий

1

Контрольная группа (практически здоровые лица), n=20

0,47±0,24

1–2: p=0,048**

1–3: p>0,05**

2–3: p=0,041**

2

Больные аллергической бронхиальной астмой, n=61

0,33±0,22

3

Больные неаллергической бронхиальной астмой, n=63

0,43±0,24

Примечание.* — для выборок, подчиняющихся нормальному распределению, указаны среднее и стандартное отклонение (М±σ) (параметрическая статистика); ** — уровень значимости, определяющий достоверность различий (для сравнения средних использован однофакторный дисперсионный анализ (с применением апостериорного критерия Тьюки).

Как следует из табл. 2, у больных АБА отмечается выраженное снижение уровня экспрессии мРНК SOCS1 в МНПК по сравнению с контрольной группой (в 1,4 раза) и группой больных НАБА (в 1,3 раза).

Для оценки роли исследуемого белка SOCS1 в клеточной сигнализации был проведен корреляционный анализ, результаты которого представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты корреляционного анализа между уровнем экспрессии белка SOCS1 в мононуклеарах периферической крови и клинико-лабораторными показателями у больных бронхиальной астмой

Показатель

Коэффициент

корреляции*

Достоверность связи

Экспрессия STAT4 (Western blotting), n=58

+0,54

p=0,0001*

Экспрессия рSTAT6 (Western blotting), n=74

+0,515

p=0,0001*

Концентрация GM-CSF в плазме крови (пг/мл), n=19

+0,44

p=0,013**

Тяжесть течения бронхиальной астмы (легкая/средняя/тяжелая), n=75

+0,25

p=0,03**

Наличие лекарственной непереносимости, n=74

+0,24

p=0,013***

Длительность курения (пачка/лет), n=23

+0,61

p=0,002*

Менопауза (да/нет), n=73

+0,33

p=0,004***

Длительность терапии пероральными глюкокортикоидами, n=13

+0,65

p=0,016*

Суточная доза парентеральных глюкокортикостероидов на день обследования, n=69

+0,22

p=0,013**

Наличие форм кардиологических заболеваний и их комбинаций (нет/ГБ/ИБС/ГБ+ИБС/ГБ+ИБС+СН

ГБ+ИБС+СН), n=35

+0,39

p=0,022***

Примечание. * — использован коэффициент корреляции Пирсона для выборок, подчиняющихся нормальному распределению; ** — при распределениях, отличающихся от нормального распределения, использован коэффициенты корреляции Кендалла и *** — Спирмена; ГБ — гипертоническая болезнь; ИБС — ишемическая болезнь сердца, СН — сердечная недостаточность.

Проведен анализ уровней экспрессии негативного регулятора транскрипции генов SOCS1 в зависимости от получаемой терапии глюкокортикостероидами (табл. 4).

Таблица 4

Уровни экспрессии SOCS1 в зависимости от наличия глюкокортикостероидной терапии (интегрированная плотность по отношению к β-актину)

Группа обследования

Значение*

Достоверность

различий

1

Практически здоровые лица, не нуждающиеся в какой-либо терапии глюкокостикостероидами, n=14

0,46±0,31

1–2: p=0,03**

1–3: p>0,05**

2–3: p=0,021**

2

Больные бронхиальной астмой, не получавшие терапию системными глюкокостикостероидами, n=25

0,2±0,22

3

Больные бронхиальной астмой, получавшие терапию системными глюкокостикостероидами, n=46

0,41±0,44

Примечание.* — для выборок, подчиняющихся нормальному распределению, указаны среднее и стандартное отклонение (М±σ) (параметрическая статистика); ** — уровень значимости, определяющий достоверность различий (для сравнения средних использован однофакторный дисперсионный анализ с применением апостериорного критерия Геймса — Хоуэлла).

Таким образом, исследование экспрессии негативного регулятора транскрипции генов SOCS1 в МНПК с использованием поликлональных антител и иммуноблоттинга, а также экспрессии мРНК методом RT-PCR показало, что в группе больных АБА уровни экспрессии негативного регулятора SOCS1 и мРНК SOCS1 снижены по сравнению с контрольной группой вне зависимости от фазы и тяжести течения БА. У больных НАБА существенных различий по сравнению с контрольной группой не выявлено. В условиях действия системных глюкокортикостероидов повышается экспрессия белка-регулятора SOCS1.

Несомненно, заслуживают внимания данные корреляционного анализа, свидетельствующие о сложной роли исследуемого белка-регулятора SOCS1 в клеточной сигнализации. Наличие положительных корреляционных связей между уровнем экспрессии негативного регулятора транскрипции генов SOCS1 и активной формой pSTAT6, уровнем экспрессии STAT4, а также корреляционной связи между экспрессией мРНК SOCS1 (RT-PCR) и экспрессией мРНК IFNγ (RT-PCR) (r=0,22; p=0,026; n=107) указывает на возможную роль SOCS1 в регуляции cross-talk взаимодействий. Гипотетическая схема клеточной сигнализации в данном случае может выглядеть следующим образом:

↑ IL-4 → ↑ pSTAT6 → ↑ SOCS1 → ↑ STAT4 → ↑ IFNγ → ↓ IL-4

Представляют интерес полученные корреляционные связи между уровнем экспрессии SOCS1 и наличием лекарственной сенсибилизации, стажем курения, наличием кардиологической патологии, наличием менопаузы (у женщин) и тяжестью течения заболевания. Отметим, что также выявлены положительные корреляционные связи между тяжестью течения БА и наличием сахарного диабета (r=0,246; p=0,004; n=125), кардиологической патологии (r=0,438; p=0,0001; n=125), патологии желудочно-кишечного тракта (r=0,233; p=0,006; n=125).

Обсуждая влияние терапии глюкокортикостероидами у больных БА на уровень экспрессии SOCS1, необходимо отметить, что выявленная положительная корреляционная связь между уровнем экспрессии данного белка-регулятора и дозой парентеральных глюкокортикостероидов позволяет предполагать повышение экспрессии SOCS1 в условиях указанной терапии.

Как видно из табл. 4, у больных БА, получавших терапию системными глюкокортикостероидами, уровень экспрессии негативного регулятора транскрипции генов SOCS1 в 2 раза больше, чем у больных, не получавших данную терапию, и практически достигает уровня экспрессии, характерного для контрольной группы (практически здоровых лиц). Это согласуется с данными литературы. Так, в частности, было показано, что глюкокортикостероиды индуцируют мРНК SOCS1. При этом точные механизмы остаются пока до конца не ясными [6].

С другой стороны было установлено, что в ранней фазе глюкокортикостероидной стимуляции происходит формирование внутриклеточного комплекса белка-регулятора SOCS1 с глюкокортикоидным рецептором (GR), который впоследствии распадается при длительной стимуляции глюкокортикостероидами. Кроме того, показано, что под воздействием глюкокортикостероидов возрастает уровень экспрессии SOCS1 в ядре. Образование комплекса GR-SOCS1 может приводить к ингибированию трансактивационной активности GR и к ослаблению транскрипционной активации регулируемых глюкокортикостероидами генов [7]. В этой связи конститутивно повышенная экспрессия SOCS1 при некоторых хронических воспалительных заболеваниях может приводить к снижению чувствительности к глюкокортикоидам и к ослаблению лечебного эффекта [9].

Тем не менее, в физиологических условиях описанный выше механизм негативных cross-talk взаимодействий между SOCS1 и GR направлен на предупреждение одновременной активации таких мощных внутриклеточных ингибиторов цитокиновой сигнализации, участвующих в противовоспалительном ответе [12].

Таким образом, необходимо отметить, что снижение экспрессии негативного белка-регулятора SOCS1, а также уровня экспрессии мРНК SOCS1 у больных аллергической бронхиальной астмой может указывать на дефектность в системе негативного контроля, заключающуюся, вероятно, в генетически обусловленном нарушении регуляции экспрессии ключевого негативного регулятора транскрипции генов SOCS1, как на уровне транскрипции и трансляции, так и на уровне синтезированного белка. Выявленный факт, по-видимому, может отражать концепцию дефектности негативной регуляции при атопической бронхиальной астме [1, 4].

Благодарности

Авторы выражают благодарность за непосредственное методическое содействии заместителю директора по научной работе НИИ микробиологии им. Л. Пастера, члену-корреспонденту РАМН, профессору, д. м. н. А.А. Тотоляну и с. н. с., к. м. н. К.А. Сысоеву, а также руководителю отдела «Внутриклеточной сигнализации и транспорта» Научно-исследовательского института цитологии РАН, академику, профессору, д. б. н. Н.Н. Никольскому и с. н. с., к. х. н. Е.Б. Буровой.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление