Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2012, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2012

Функционирование эффекторных и регуляторных Т-лимфоцитов при нарушении толерантности к углеводам и сахарном диабете 2-го типа, ассоциированных с артериальной гипертензией


И.В. Кологривова, Т.Е. Суслова, О.А. Кошельская, И.В. Винницкая, О.А. Журавлева, Е.С. Никонова

Методом проточной цитометрии оценивали концентрацию цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNFα и IFNγ в сыворотке крови, относительное содержание Foxp3+-Т-регуляторных лимфоцитов (Foxp3+-Treg) и внутриклеточную продукцию цитокинов Т-хелперами 1-го и 17-го типов (Th1 и Th17) в группах пациентов с нарушением толерантности к углеводам (НТУ) и сахарным диабетом (СД) 2-го типа в сочетании с артериальной гипертензией (АГ). При НТУ было отмечено увеличение содержания IL-6 в сыворотке, возрастание относительного количества Th1, Th17 и двойных позитивных Th17/Th1 лимфоцитов, увеличение количества лимфоцитов, представляющих рецептор к IL-23, а также отрицательная корреляционная связь между содержанием Т-регуляторных лимфоцитов и уровнем экспрессии транскрипционного фактора Foxp3 в них. При СД 2-го типа наблюдалось увеличение содержания IL-4, IL-6, IL-17A и TNFα в сыворотке крови, снижение содержания Foxp3+-Treg и увеличение процента Th1-лимфоцитов, продуцирующих IFNγ при стимуляции форболовым эфиром и иономицином. Выявленные изменения свидетельствуют о том, что НТУ, ассоциированные с АГ, сопровождаются активацией Th1 и Th17 и снижением содержания Foxp3+-Treg. (Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. № 2. С. 38–43.)

Ключевые слова: интерлейкин-17, Foxp3+-Т-регуляторные лимфоциты, интерферон гамма, сахарный диабет 2-го типа.

В настоящее время уже не ставится под сомнение тот факт, что при сахарном диабете (СД) 2-го типа наряду с нарушениями метаболизма происходит активация механизмов врожденного иммунитета [11]. Усиливается синтез интерлейкина (IL)-1β, фактора некроза опухоли альфа (TNFα), IL-6 и C-реактивного белка [11], которые могут участвовать в развитии инсулинорезистентности, гипертензии, проатерогенного состояния и ожирения [10]. Имеются данные о том, что механизмы адаптивного иммунитета также могут вносить вклад в развитие СД 2-го типа: было показано, что высокие дозы IL-2, одного из основных цитокинов Т-хелперов первого типа (Th1), приводят к развитию инсулинорезистентности [5]. Однако роль иммунокомпетентных клеток в патогенезе СД 2-го типа по-прежнему недостаточно изучена. Более того, появляются сведения о новых регуляторных субпопуляциях лимфоцитов, которые могут являться потенциальными участниками развития СД 2-го типа.

Согласно последним данным, недавно открытые субпопуляции Т-лимфоцитов, Т-хелперы 17 (Th17) и Foxp3+-Т-регуляторные клетки (Foxp3+-Treg) способны модулировать иммунный ответ при различных патологических состояниях и осуществлять взаимосвязь между врожденным и приобретенным иммунитетом [14]. Th17 стимулируют гранулоцитопоэз, миграцию нейтрофилов и моноцитов к очагам локального воспаления, вызывают активацию синтеза провоспалительных цитокинов и экспрессию таких костимуляторных молекул, как inter-cellular adhesion molecule (ICAM)-1) [2]. Тreg, напротив, призваны контролировать силу иммунного ответа и в норме подавляют экспансию потенциально патогенных клонов Т-лимфоцитов [14]. Несмотря на то, что функции данных лимфоцитарных субпопуляций являются прямо противоположными, они тесно связаны друг с другом и на эволюционном уровне, и за счет общих факторов дифференцировки [3, 14]. При избыточной активации Th17 и количественных либо качественных нарушениях Т-регуляторных клеток создаются условия, способствующие развитию воспалительных процессов [9].

Как правило, СД 2-го типа предшествует нарушение толерантности к углеводам (НТУ), и, в большинстве случаев, оба эти состояния ассоциированы с артериальной гипертензией (АГ) [1]. Роль воспаления в развитии данных заболеваний в настоящее время широко обсуждается, однако особенности функционирования Тreg и Th17 при НТУ и СД 2-го типа, сочетающихся с АГ, пока не изучены.

Целью данного исследования явилась оценка сывороточного уровней основных иммунорегуляторных цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNFα, IFN), а также внутриклеточной экспрессии маркеров Th17, Th1 и Foxp3+-Treg в лимфоцитах периферической крови пациентов с различными степенями нарушений углеводного обмена, ассоциированными с АГ.

Материалы и методы

Исследование было выполнено в НИИ кардиологии СО РАМН на базе отделения атеросклероза и хронической ишемической болезни сердца. В результате скрининга были отобраны 10 пациентов в возрасте 51–60 лет с АГ 1 2 степени, ассоциированной с НТУ (4 мужчины и 6 женщин), и 21 пациент в возрасте 47–63 лет с АГ 1–2-й степени, ассоциированной с СД 2-го типа (9 мужчин и 12 женщин). Кроме того, были обследованы 12 практически здоровых лиц сопоставимого возраста и пола (здоровые добровольцы).

Всем пациентам проводили комплексное клинико-инструментальное и лабораторное обследование для верификации диагноза, исключения вторичных форм АГ, определения сочетания метаболических факторов риска и уточнения состояния органов-мишеней. Диагноз НТУ и СД 2-го типа был установлен врачами-эндокринологами в соответствии с критериями современной классификации СД (Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, 2002) и отечественными методическими рекомендациями Федеральной программы «Сахарный диабет» (2002). В исследование были включены больные СД 2-го типа легкого течения и средней степени тяжести. Тяжесть диабета устанавливали с учетом наличия микро- и макрососудистой патологии, а также ассоциированных заболеваний. Диагноз АГ и стратификацию риска больных устанавливали на основе рекомендаций Европейского общества кардиологов (2007) и третьего пересмотра рекомендаций российских экспертов ВНОК (2008).

Все пациенты были обследованы на фоне постоянной гипотензивной и сахароснижающей терапии. На момент обследования у пациентов и здоровых добровольцев отсутствовали клинические и лабораторные признаки острого воспаления.

Материалом для исследования являлась венозная кровь, взятая утром натощак. В сыворотке крови определяли содержание IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNFα и IFNγ c использованием цитометрического набора микрогранул (CBA) для одновременного определения цитокинов (набор Human Th1/Th2/Th17, BD, USA) и программного обеспечения CellQuestPro и FCAP (BD Pharmingen, USA). В набор входила смесь семи видов микрогранул с различной интенсивностью флуоресценции, связанных с соответствующими моноклональными антителами к цитокинам человека. Сыворотку крови или стандартные растворы добавляли к предварительно подготовленной смеси фикоэритрин (РЕ)-конъюгированных антител к цитокинам человека. Реакционную смесь инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте. Затем несвязавшиеся антитела удаляли путем центрифугирования с фосфатно-солевым буфером. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 300 мкл фосфатно-солевого буфера. Определение содержания цитокинов проводили на проточном цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) по интенсивности флуоресценции исследуемых образцов.

Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной крови путем центрифугирования на градиенте плотности (Histopaque 1119, Sigma Aldrich). Относительное содержание Th17 и Th1 оценивали по способности лимфоцитов к спонтанной и стимулированной внутриклеточной продукции IL-17 и IFNγ, соответственно. С целью идентификации Treg определяли внутриклеточную экспрессию транскрипционного фактора Foxp3. Для оценки внутриклеточной продукции цитокинов клетки культивировали в течение 6 ч на полной среде RPMI 1640 при 37 °С и концентрации СО2 5 %. Часть фракции мононуклеаров стимулировали форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА) в концентрации 50 нг/мл (Sigma Aldrich) и иономицином (1 мкг/мл, Sigma Aldrich) в присутствии брефельдина А (Golgistop, BD Pharmingen) в концентрации, рекомендуемой производителем. Часть фракции мононуклеров периферической крови оставляли нестимулированными для оценки спонтанной внутриклеточной продукции цитокинов.

Для определения фенотипа клеток были использованы следующие моноклональные антитела: фикоэритрин карбоксициан-5 (PECy5)-меченные анти-CD4, флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-меченные анти-CD4, аллофикоцианин (APC)-меченные анти-IL-23R, APC-меченные анти-CD25 (все антитела производства Becton Dickinson, USA). Для внутриклеточного окрашивания клетки фиксировали 1 % параформальдегидом (CellFIX, BD Biosciences) и пермеабилизировали FACS-пермеабилизирующим раствором в соответствии с рекомендациями производителя. Затем клетки инкубировали с PE-меченными анти-IL-17, FITC-меченными анти-IFNγ и РЕ-меченными анти-Foxp3 антителами в течение 30 минут при комнатной температуре. После окрашивания клетки отмывали однократно и фиксировали 1 % параформальдегидом (CellFIX, BD Biosciences). Был использован соответствующий изотипический контроль. Пробы анализировали на четырехцветном проточном цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) с использованием программного обеспечения CellQuestPro (BD). Результаты учитывали по проценту клеток от CD4+-лимфоцитов и по средней интенсивности флуоресценции.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ SPSS 11.5 for Windows. Для определения характера распределения параметров в выборках использовали критерий Шапиро — Уилка. Оценку достоверности различий между выборками проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна — Уитни и критерия Вилкоксона. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление