197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2012, № 4

Сравнительные эффекты клеток фенотипа CD34⁺CD45^dim и синтетических пептидов активного центра GM-CSF на процессы репарации кожной раны в эксперименте

В.А. Зурочка,А.В. Зурочка,Е.Г. Костоломова,Ю.Г. Суховей,А.А.Колобов, А.С.Симбирцев

Исследование заживления ран у мышей под действием различных пептидных препаратов и фетальных клеток показало, что особенностью действия препарата, содержащего клетки CD34⁺45^dim и синтетические пептиды — аналоги активного центра GM-CSF, является отсутствие выраженного инфицирования во все сроки изучения и более быстрое закрытие раневого дефекта. Клинический эффект применения аллогенных прогениторных клеток и синтетических пептидов фрагментов цитокинов костно-мозгового происхождения позволяет сделать вывод об индуцирующем влиянии данных препаратов на течение процессов репаративной регенерации. (Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. № 4. С. 21–25 ).

Ключевые слова: клетки-предшественники, GM-CSF, синтетические пептиды, репарация ран.

Начиная с 90-х годов прошлого столетия начаты исследования по изучению репаративных свойств аллогенных прогениторных клеток. Их клинический эффект объясняется неспецифическим механизмом действия. Тем не менее, несмотря на перспективность применения фетальных протеинов в терапии различных нозологических единиц, следует констатировать недостаточный уровень изученности механизмов их действия на течение раневого процесса [3, 4]. В последние годы появились данные о плейотропных механизмах действия иммунотропных пептидов. Наиболее перспективными из них являются синтетические аналоги активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) [1, 2]. Поэтому важно было выявить, обладают ли данные соединения репаративной активностью и способны ли данные пептиды оказывать столь же выраженные репаративные эффекты, как и клетки фенотипа CD34⁺45^dim.

Цель исследования — изучить влияние аллогенных прогениторных клеток фенотипа CD34⁺45^dim и синтетических пептидов активного центра GM-CSFна механизмы репаративной регенерации.

Материалы и методы

Репарационную активность различных веществ и клеток изучали на модели открытой раны. Для стандартизации площади и глубины формирования раны использовали трафарет из тонкого оргстекла с отверстием 3,5×7,2 мм. К животному под легким эфирным наркозом прикладывали трафарет, вытягивали за шерсть кожу на высоту 1 мм и делали срез. В результате получали открытую рану площадью 7–10 мм² на глубину кожного покрова. Резаные раны наносили с помощью хирургических ножниц и шаблона в виде пластины из пластика, имеющей отверстие диаметром 1 см. Шаблон прикладывали к телу, вытягивали шкуру пинцетом на 1 см и иссекали ножницами. В результате формировалась рана площадью около 1 см². Резаные раны были бледно-розовыми, гладкими, мягкими, без больших кровопотерь.

Препараты с разным действующим веществом наносили на раны шпателем. Исследуемые препараты наносили на раны через день в количестве 100 мкл в течение 5 дней.

Исследование было проведено на 80 лабораторных мышах–самцах, имевших возраст 3–4 месяца, вес 20–25 г.

В эксперименте животные были разделены на 8 экспериментальных групп (по 10 мышей в каждой):

1-я (контрольная группа) — без лечения, 2-я (опытная группа № 1) — с ранами, обработанными основой для геля (2 % раствор целюлозы), 3-я (опытная группа № 2) — с ранами, обработанными лекарственной мазью солкосерил, 4-я (опытная группа № 3) — с ранами, обработанными гелем, содержащим фетальные клетки фенотипа CD34⁺45^dim, 5-я (опытная группа № 4) — с ранами, обработанными гелем с дефенсином LL37, 6-я (опытная группа № 5) — с ранами, обработанными гелем с дефенсином MNP1–3, 7-я (опытная группа № 6) — с ранами, обработанными гелем с пептидом ZP 1 (химическая формула: LYS-GLY-PRO-LEU-THR-NLE-NLE-ALA-SER-HIS-TYR-LYS-GLN-HIS-CYS-PRO) и 8-я (опытная группа № 7) — с ранами, обработанными гелем с пептидом ZP 2 (химическая формула: THR-NLE-NLE-ALA-SER-HIS-TYR-LYS-GLN-HIS-CYS-PRO). Концентрации пептидов ZP 1 и ZP 2 составили 10 мкг/мл.

Синтез пептидов проводили твердофазным способом на синтезаторе «Applied Biosystems 430A» по методу in situ c использованием Nα-Boc-защищенных производных аминокислот. Для блокирования боковых цепей трифункциональных аминокислотных остатков использовали защитные группы бензильного и уретанового типов. Присоединение аминокислотных остатков проводили методом 1-гидроксибензотриазоловых эфиров, используя 5-кратные избытки реагентов. По завершении сборки полипептидной цепи пептидил-полимер обрабатывали жидким фтористым водородом по Sn1/Sn2-механизмам в присутствии скавенджеров. Продукт высаживали диэтиловым эфиром и очищали методом препаративной обращенно-фазовой хроматографии до гомогенного состояния. Конечные продукты охарактеризованы данными аминокислотного и масс-спектрального анализов и аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Аминокислотный состав полученных соединений и их молекулярный вес соответствовали теоретическим, чистота, по данным аналитической ОФ ВЭЖХ, была не менее 95 %. В качестве дополнительных контролей были использованы рекомбинантные пептиды HNP 1–3 (представитель семейства альфа-дефенcинов человека) и LL37 (представитель семейства кателицидинов) производства компании HyCult biotechnology (Нидерланды).

Для анализа динамики заживления проводили измерение площади раневой поверхности. Для этого на рану накладывали стерильную пластинку целлофана и на нее маркером переносили контуры раны. Затем дважды проводили измерение диаметра контура раны штангенциркулем и, с учетом среднего значения, вычисляли площадь раны по формуле S = πАВ, где А и В — радиусы эллипса. Затем рассчитывали посуточное уменьшение площади раны в процентах.

Для гистологического изучения материала выполняли биопсию раны. Отбор биопсийного материала производили на 1-е, 5-е, 7-е, 10-е и 15-е сутки от трех животных из каждой экспериментальной группы. Материал фиксировали в 96 % этиловом спирте, заливали в парафин и готовили гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином Майера и эозином с последующим анализом морфологической картины.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.