Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2012, № 4

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 4'2012

Экспрессия TLR2 и TLR4 в мононуклеарных клетках периферической крови больных острым деструктивным панкреатитом

Л.В. Ковальчук, В.А. Горский, М.В. Хорева, М.А. Агапов, Н.В. Давыдова, И.В. Леоненко

Недавние исследования установили ведущую роль воспалительных медиаторов в патогенезе острого панкреатита. Одним из механизмов запуска всего каскада воспаления является активация компонента системы врожденного иммунитета — Toll-подобных рецепторов. В настоящем исследовании проанализирована возможность воздействия на уровень экспрессии матричной РНК TLR2- и TLR4-рецепторов в мононуклеарных клетках периферической крови больных острым панкреатитом посредством антимедиаторной терапии. (Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. № 4. С. 50–55.)

Ключевые слова: острый панкреатит, Toll-подобные рецепторы, антимедиаторная терапия.

Toll-подобные рецепторы (TLR) относятся к семейству паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета. Они играют центральную роль в распознавании микробных патогенов клетками иммунной системы, однако распознавание лигандов только микробного происхождения не может объяснить все функции TLR. В последние годы проводится все больше исследований, доказывающих, что эндогенные лиганды также активируют рецепторы врожденного иммунитета и запускают асептическое воспаление, которое развивается в ответ на травму, ишемическую болезнь, массивное тканевое повреждение при отсутствии патогенной инфекции и сопровождается высокой выработкой провоспалительных цитокинов [3, 15, 22, 25]. Такие лиганды получили обозначение «сигналы опасности», или damage-associated molecular pattern (DAMP). К эндогенным активаторам TLR относятся белки теплового шока HSP60 и HSP70, фибронектин, гиалуроновая кислота и многие другие, высвобождающиеся в результате распада молекул внеклеточного матрикса, а также некроза клеток и массивной деструкции тканей [2, 18]. В физиологических концентрациях эндогенные лиганды способствуют процессам восстановления и заживления тканей, тогда как высвобождение эндогенных лигандов в избыточных количествах может привести к повреждению тканей.

Острый деструктивный панкреатит (ОДП) — локальное воспаление ткани поджелудочной железы, которое может быть результатом действия различных факторов: обструкции, гиперсекреции ацинарных клеток, ишемии и др. Тяжелый панкреатит сопровождается быстрым развитием системной воспалительной реакции и может привести к полиорганной недостаточности. Известно, что нарушения в иммунной системе — как в адаптивном, так и во врожденном иммунитете — играют ведущую роль в патогенезе острого панкреатита. Провоспалительные цитокины, такие как IL-1, IL-6, IL-8 и TNFa, а также циклооксигеназа (ЦОГ) и другие медиаторы воспаления вносят существенный вклад в развитие воспаления при ОДП [5, 13, 14, 20]. Другим важным компонентом, который участвует в развитии каскада воспалительных событий при ОДП, могут быть TLR [26]. Показано, что лиганды эндогенного происхождения, высвобождаемые при клеточной деструкции, такие как гепаран сульфат и панкреатическая эластаза, могут активировать TLR, способствуя выбросу провоспалительных цитокинов при остром панкреатите [4]. Известно, что большинство эндогенных лигандов взаимодействуют с TLR2 и TLR4-рецепторами [5]. На модели острого панкреатита у мышей показано, что экспрессия мРНК TLR4 повышена в поджелудочной железе на ранней стадии заболевания [19].

На кафедре иммунологии ГОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова в последние годы проводятся исследования по изучению роли TLR при острых патологических состояниях и разработана концепция комплексной оценки разных уровней функционирования системы TLR-рецепторов. Мы выявили, что у больных ОДП значительно повышены эффекторные функции TLR4- и TLR1/2-рецепторов на мононуклеарных клетках периферической крови, что может быть связано с их более высокой экспрессией клетками на начальной стадии заболевания. Использование лорноксикама — нестероидного противовоспалительного препарата группы оксикамов в комплексном лечении пациентов с ОДП приводило к снижению выработки провоспалительных цитокинов у этих больных [1].

В настоящем исследовании проанализирована экспрессия мРНК TLR2- и TLR4-рецепторов в мононуклеарных клетках периферической крови больных ОДП, получавших только стандартную терапию, и больных, получавших комплексную терапию с включением лорноксикама.

Материалы и методы

Исследование проведено на кафедрах иммунологии и экспериментальной и клинической хирургии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Были обследованы 19 больных в возрасте от 20 до 60 лет с ОДП токсической этиологии средней и тяжелой степени. Оценку степени тяжести проводили по международной шкале APACHE II. Все пациенты получали стандартную терапию, предусмотренную протоколом ведения больных с ОДП. Пациенты 1-й группы (n=10) получали только стандартную базисную терапию, 2-й (n=9) — комплексную терапию с добавлением нестероидного противовоспалительного препарата лорноксикама. Периферическую кровь для исследования забирали у больных на 1-е, 3-и, 7-е и 14-е сутки после госпитализации.

Группу здоровыхдоноров составили 20 человек в возрасте 20–45 лет: 11 мужчин и 9 женщин. Донорская кровь была любезно предоставлена отделением переливания крови и гравитационной хирургии РДКБ.

Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной периферической крови (25 ЕД/мл крови) здоровых доноров и больных ОДП в одноступенчатом градиенте плотности фиколла–урографина (Pharmacia, ρ=1,077 г/см3). Рабочая концентрация клеток составляла 1´106/мл среды RPMI 1640 (Sigma), содержащей 5 % сыворотки эмбрионов коров («HyClone, Perbio»), 2 мМ L-глутамина (НПП «ПанЭко»), антибиотик гентамицин 100 мкг/мл (ОАО «Дальхимфарм», г. Хабаровск). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью 0,1 % раствора трипанового синего. Выделенные клетки хранили в растворе для стабилизации РНК «RNAlater RNA stabilization reagent» («Qiagen») при –70º С.

Для выделения РНК из МНК периферической крови человека использовали коммерческие наборы «RNeasy Plus Mini Kit» («Qiagen», USA) в соответствии с инструкцией по применению. Каждый образец содержал 1´106 клеток. Концентрацию выделенной из образцов РНК измеряли на спектрофотометре Picodrop («Thermo scientific», США), ее величина в образцах доноров и пациентов составила 16–80 нг/мкл. Рекомендуемая концентрация для проведения реакции обратной транскрипции от 1 пг/мкл до 1 мг/мкл.

Для проведения реакции обратной транскрипции были использованы равные количества РНК от здоровых доноров и пациентов с ОДП. Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 20 мкл на приборе «Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System» c использованием набора реагентов «High capacity RNA to cDNA Master mix» («Applied Biosystems», USA). Полученную кДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Постановка полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени, метод ∆∆Сt. Анализ проводили на приборе Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Смесь для реакции готовили по инструкции к реагентам «Taqman Gene Expression Master Mix», использовали набор праймеров для определения генов tlr2 (Hs01014511-m1, Applied Biosystems), tlr4 (Hs00152939-m1, Applied Biosystems). Реакционная смесь содержала 12,5 мкл «Taqman Gene Expression Master Mix», 1,25 мкл праймеров, 2,5мкл кДНК в общем объеме 25 мкл. Уровни экспрессии TLR нормировали по гену β-актина («Human ACTB Endogenous Control» (FAM / MGB Probe), Applied Biosystems, США). Режим для проведения реакции амплификации: 2 мин при t=50 ºС, 10 мин при t=95 ºС, 15 с при t=95 ºС, 1 мин при t=60 ºС. Количество циклов 40. Расчет осуществляли в программе к прибору Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, версия 2.0.5. Метод ∆∆Сt — это относительный метод измерения, при применении которого получали результаты в виде относительных единиц (ОЕ), которые показывают уровень экспрессии гена-мишени в исследуемом образце по отношению к калибратору. В качестве шага 1 проводили нормализацию по эндогенному контролю (Ct гена-мишени — Ct эндогенного контроля=∆Ct); шаг 2: нормализация по калибратору (∆Ct образца — ∆Ct калибратора=∆∆Ct), ОЕ=2-∆∆Ct. ОЕ показывают уровень экспрессии гена-мишени в исследуемом образце по отношению к калибратору (за калибратор принимали пулированную кДНК доноров).

Статистическую обработку результатов проводили в программном пакете StatSoft Statistica с использованием непараметрических критериев. Результаты выражали в виде среднего арифметического для анализируемой группы показателей±стандартное отклонение. Для сравнения групп по количественным признакам использовали U-критерий Манна —Уитни и критерий Вилкоксона. Различия показателей в группах считали статистически значимым при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление