Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2013, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2013

Комбинация различных стратегий, направленных на повышение эффективности противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток

О.В. Скачкова, Н.Н. Храновская, В.В. Ситько, Н.Н. Свергун,

Национальный институт рака, г. Киев, Украина

Ключевые слова: комбинированная иммунотерапия, циклофосфамид, IFNγ, дендритные клетки.

Разработана схема комбинированной иммунотерапии на основе низких доз циклофосфамида (ЦФ), IFNγ и противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток. Изучены механизмы действия комбинированной иммунотерапии на основе исследований уровня экспрессии цитокинов (IFNγ,IL-4, IL-10, TGFβ), а также ее влияние на количество и функциональное состояние Т-регуляторных (Т-рег) лимфоцитов. Установлено, что комбинированная иммунотерапия усиливает формирование иммунного ответа по Th1-типу, не вызывает количественные изменения в субпопуляции Т-рег лимфоцитов, однако влияет на их функциональное состояние, подавляя экспрессию генов IL-10 и TGFβ лимфоцитами как селезенки, так и лимфоузлов. (Цитокины и воспаление. 2013. Т. 12. № 1–2. С. 108–114.)

Несмотря на значительные достижения в изучении механизмов возникновения и развития онкологических заболеваний, эффективность разработанных методов лечения в отношении многих видов злокачественных опухолей все еще остается неудовлетворительной. Одним из наиболее перспективных путей повышения эффективности основных методов лечения злокачественных новообразований является разработка методов, направленных на активацию противоопухолевого иммунитета путем проведения специфической иммунотерапии. Среди них особое место занимают методы противоопухолевой вакцинотерапии [3].

На основании многочисленных исследований последних лет были сформулированы основные требования для достижения максимального эффекта специфической иммунотерапии в онкологии, а именно: а) использование поливалентного антигена, охватывающего широкий спектр опухолеассоциированных антигенов (ОАА); б) использование различных адъювантов с целью усиления иммунного ответа; в) снижение активности или устранение действия негативных факторов, подавляющих иммунный ответ; г) комбинирование нескольких иммунологических подходов, действие которых будет направлено на различные звенья иммунной системы [10].

Среди методов специфической иммунотерапии особое место занимают методы вакцинотерапии с привлечением в качестве мощного естественного адъюванта антиген-презентирующих дендритных клеток (ДК) [11]. Такие вакцины имеют ряд преимуществ: идентичность по гаплотипу главного комплекса гистосовместимости (МНС) реципиента, возможность обеспечения вакцинации с помощью уникального набора антигенов, ассоциированных с опухолью данного пациента, возможность преодоления проблем, связанных с низкой иммуногенностью ОАА и их доставкой во вторичные лимфоидные органы к иммунокомпетентным клеткам, формирующим специфический иммунный ответ. Известно, что ДК обладают способностью во вторичных лимфоидных органах оптимальным образом представлять ОАА Т-лимфоцитам в комплексе с молекулами МНС I и II классов, множеством вспомогательных молекул, которые взаимодействуют с рецепторами на Т-клетках, усиливая их адгезию и костимуляцию [5].

Весьма перспективным подходом для повышения терапевтического потенциала иммунотерапии на основе ДК является комбинированное ее применение с неспецифическими стимуляторами природного иммунитета — цитокинами. В этом аспекте рассматриваются провоспалительные Т-клеточные цитокины: IL-2, IL-12 и интерфероны (IFN). Наиболее привлекательным по своим биологическим свойствам является IFNγ [1]. Он обеспечивает взаимодействие между лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками (АПК), способствует повышению функциональной активности последних, усиливая секрецию IL-2 и IL-12. Кроме того, IFNγ способствует повышению экспрессии антигенов МНС І класса на опухолевых клетках и антигенов МНС ІІ на АПК, что делает опухоль более чувствительной к действию иммунотерапии. Его противоопухолевая активность также связана с активацией натуральных киллерных клеток (НКК), цитотоксических Т-лимфоцитов и макрофагов.

По мере увеличения объема знаний о различных популяциях регуляторных клеток, их вклада в иммунную дисфункцию при злокачественных новообразованиях расширяются показания к применению стратегий управления этими клетками в терапии онкологических больных. Многочисленные исследования показали, что предварительная кратковременная деплеция регуляторных CD4+CD25+Fox-P3+ Т-лимфоцитов (Т-рег) может значительно усилить терапевтический эффект различных видов иммунотерапии, особенно противоопухолевой вакцинотерапии [4].

К настоящему времени продемонстрирована способность ряда противоопухолевых препаратов (при метрономном режиме их применения) оказывать регулирующее влияние на количество и функциональную активность Т-рег. В частности, химиотерапевтический препарат циклофосфамид (ЦФ) в низких дозах приводит к снижению числа и функциональной активности Т-рег. Снижение экспрессии glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) и транскрипционного фактора Fox-P3 под влиянием ЦФ, полагают, опосредует уменьшение их супрессорной активности [8, 12, 13].

Элиминация иммуносупрессивных факторов под влиянием химиопрепаратов указывает на целесообразность комбинирования химио- и иммунотерапевтических подходов в таких режимах, когда применение биопрепаратов и цитостатиков способствует достижению синергизма их действия [7].

Принимая во внимание вышеизложенное, цель работы состояла в исследовании эффективности разработанной схемы комбинированной иммунотерапии на основе ДК-вакцины, низких доз ЦФ и IFNγ в эксперименте на модели метастазирующей опухоли карциномы легкого Льюис.

Материалы и методы

В эксперименте были использованы 100 мышей линии С57Bl/6 (самцы весом 18–22 г в возрасте 1,5–2 месяца) из вивария Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины. Все процедуры с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Совета Европейского Союза 86/609/ЕС «О сближении законов, постановлений и административных положений государств ЕС по вопросам защиты животных, используемых для экспериментов и других научных целей» от 24 ноября 1986 г.

В качестве экспериментальной опухолевой модели была использована линия опухолевых клеток карциномы легкого Льюис (КЛ), характеризовавшаяся активным метастазированием в легкие. Клетки КЛ вводили животным внутривенно (в/в) в орбитальный синус глаза в концентрации 300 × 103 клеток/мышь. На 5-й день после трансплантации КЛ начинали вводить ЦФ в концентрации 2 мг/мышь внутрибрюшинно, ежедневно, всего препарат вводили 4 раза. Общая доза ЦФ на курс составила 8 мг. Цитокинотерапию с помощью IFNγ начинали на следующие сутки после последнего введения ЦФ, препарат вводили подкожно, всего 4 раза, через сутки, в концентрации 5000 МЕ/мышь. ДК-вакцинотерапию начинали на следующий день после первого введения IFNγ. ДК-вакцину вводили в/в 3 раза каждые 3 суток (см. рис. 1). На 28 сутки после трансплантации КЛ животных умерщвляли методом цервикальной дислокации и проводили подсчет количества и объема метастазов, а также забор биологического материала (селезенка, паховые лимфоузлы) для молекулярно-генетических и иммунологических исследований.

В ходе эксперимента животные были распределены на следующие группы: 1) контроль КЛ; 2) КЛ + ЦФ; 3) КЛ + IFNγ; 4) КЛ + ДК-вакцина; 5) КЛ + ЦФ + IFNγ + ДК-вакцина. Каждая экспериментальная группа состояла из 10 животных.

Получение ДК. Для экспериментальных исследований в качестве источника ДК были использованы спленоциты интактных сингенных мышей. ДК получали по следующей методике с соблюдением правил асептики [6]. Ткань селезенки измельчали в среде RPMI 1640 и фильтровали через нейлоновый фильтр для получения однородной клеточной суспензии. Клетки в концентрации 5 × 106 /мл инкубировали при 37 °С и 5 % СО2 на протяжении 24 ч в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 200 ммоль/л глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 25 ммоль/л 2-меркаптоэтанола. Клетки, которые не прикрепились к пластику, концентрировали и центрифугировали 15 мин при 1000 об./мин на градиенте плотности 14,5 % метризамида. Более чем 80 % интерфазных клеток по своим морфологическим признакам относились к ДК. ДК нагружали опухолевым антигеном следующим образом: клетки инкубировали в концентрации 1 × 106 /мл в среде RPMI-1640 на протяжении 4 часов при 37 °С и атмосфере 5 % СО2 в присутствии механохимически гетерогенизированных лиофилизированных опухолевых клеток. Затем отмывали ДК центрифугированием при 1500 об./мин на протяжении 10 мин в забуференном физиологическом растворе и доводили концентрацию клеток до 1 × 106/мл. ДК-вакцину вводили в/в в концентрации 200 × 103 /мышь.

Определение уровня экспрессии мРНК генов цитокинов. Для исследования уровня экспрессии генов цитокинов часть селезенки или лимфатического узла (л/у) не позже, чем через 30 мин после удаления помещали в микропробирки с 0,3 мл раствора RNA-later («Ambion», USA) для стабилизации РНК. Для выделения тотальной РНК методом кислотно-фенольной экстракции использовали ПЦР-тест-набор «Рибозоль-A» («AmpliSens», Россия), затем полученную РНК обрабатывали ДНКазой («Ambion», USA) для избавления от геномной ДНК, которая может быть источником ошибочных результатов. Для получения кДНК проводили реакцию обратной транскрипцию с использованием ПЛР-тест-набора «Реверта-L-100» («AmpliSens», Россия). Полученный образец кДНК до постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) хранили при температуре минус 70 °С.

Уровень экспрессии генов IFNγ,IL-10, TGFβ, IL-4 определяли с помощью ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени на приборе 7500 Real-Time PCR Systems («Applied Bіosystems», USA) с использованием специфических праймеров и флуорохрома SYBRGreen (С32Н37N4S+) с пиком поглощения λmax= 488 нм и флуоресценцией λmax= 522 нм. Последовательности праймеров были подобраны экспериментально с использованием программы Primer Express® Software v3.0 («Applied Bіosystems», USA) и синтезированы фирмой «Applied Bіosystems» (USA). Уровни экспрессии генов-мишеней оценивали с помощью метода ∆∆Ct с нормированием относительно экспрессии эндогенного контроля. Уровни экспрессии эндогенного контроля вычитали из уровней экспрессии генов–мишеней. В качестве эндогенного контроля использовали глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH).

Определение количества и функциональной активности различных субпопуляций клеток селезенки. Определение количества клеток селезенки различных субпопуляций проводили с использованием проточного цитофлюориметра и моноклональных антител (МКАТ) антител CD4-FITC, CD25-PE, CD69-FITC («Becton Dickinson», USA).

Функциональную активность НКК селезенки мышей оценивали с использованием проточного цитофлуориметра. В качестве клеток–мишеней использовали мышинную лимфому ОН-1, полученную из трансплантированных лимфом идуцированных Bac. megaterium H. у мышей линии А.

Все проточноцитометрические исследования проводили на приборе FACS Сalibur («Becton Dickinson», USA), оснащенном двумя лазерами (длиной волны 488 и 625 нм) с использованием программы CellQuest-PRO для получения и анализа данных.

Антиметастатический эффект иммунотерапии оценивали по частоте метастазирования опухоли. Для этого проводили подсчет количества и объема метастатической колонии в легких мышей. Объем колонии вычисляли по формуле: V=0,52D3, где 0,52 — коэффициент; V — объем метастатической колонии; D — ее диаметр (мм).

Рассчитывали также индекс ингибирования метастазирования (ИИМ) по формуле: ИИМ (%) = [K – O] : K] × 100, где К и О — средний объем метастазов на мышь в контрольной и опытной группах, соответственно.

Статистические методы. Статистическую обработку данных проводили с использованием методов параметрической (t-критерий Стьюдента) и непараметрической статистики (критерий Вилкоксона — Манна — Уитни).

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление