Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2013, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2013

Гранулематозное воспаление у инбредных мышей разных линий: сравнительное исследование

Я.Ш. Шварц, С.В. Чересиз, Е.А. Чересиз

Проведено сравнительное исследование динамики формирования, персистенции и обратного развития гранулематозных инфильтратов в печени, легких и в подкожной клетчатке, индуцированных разными дозами фиброгенных частиц (двуокись кремния) или нефиброгенными частицами (зимозан) у мышей линий C3H/F, BALB/c, CBA/Lac, C57BR и C57Bl/6, существенно различающихся по индуцибельности 3-гидрокси-3-метил-глютарил-КоА редуктазы (ГМГ-КоА редуктаза). Показано, что межлинейные различия выраженности гранулемообразования и фиброгенного ответа коррелируют с активностью миелопоэза и имеют характер закономерности, оставаясь устойчивыми вне зависимости от локализации процесса, природы, дозы и пути введения воспалительного агента. Оценена способность макрофагов мышей разных линий продуцировать про- (GM-CSF, TNFα, NO) и антивоспалительные (IL-10, TGFβ1) медиаторы и цитокины и установлен отчетливый паралеллизм между реактивностью клеток макрофагальной системы, уровнем гранулемогенного и фиброгенного ответа, с одной стороны, и линиеспецифической индуцибельностью ГМГ-КоА редуктазы, ключевого фермента мевалонатного метаболического пути — с другой. Сделано предположение о важной роли данного метаболического пути в регуляции реактивности макрофагов при воспалительном ответе. (Цитокины и воспаление. 2013. Т. 12. № 1–2. С. 26–33.)

Ключевые слова: гранулематозное воспаление, реактивность макрофагов, 3-гидрокси-3-метил-глютарил-КоА редуктаза.

Гранулематозный процесс лежит в основе огромного числа хронических воспалительных заболеваний и направлен на секвестрацию и последующую деградацию персистирующего чужеродного материала, не способного подвергаться быстрому клиренсу и элиминации из организма. Основным клеточным субстратом гранулем являются мононуклеарные фагоциты. Фиброзирующие гранулемы содержат также заметное количество фибробластов, а гранулемы, индуцированные иммуногенным материалом, в дополнение к мононуклеарным фагоцитам, — Т-, В-, дендритные и другие клетки. Неэффективное развитие гранулематозного ответа при внутриклеточной инфекции приводит к нарушению дифференцировки и активации моноцитов-макрофагов (Мн-Мф) в очаге инфильтрации и к диссеминации инфекционного агента. При этом выраженность гранулематозной инфильтрации определяется множеством факторов, важнейшими из которых являются: 1) активность продукции хемоаттрактантов, колониестимулирующих факторов (CSF) и других медиаторов и цитокинов в очаге повреждения, 2) уровень миелопоэтического ответа, генерирующего прекурсоры Мн-Мф, 3) эффективность эмиграции прекурсоров из органов миелопоэза в кровоток, 4) преодоление трансэндотелиального барьера/экстравазация Мн-Мф в зоне воспаления, 5) направленная миграционная активность/рекрутирование Мн-Мф, 6) их ретенция в фокусах мононуклеарной инфильтрации, 7) пролиферация клеток инфильтрата in situ.Мы предположили, что выраженность мононуклеарной инфильтрации может в значительной мере определяться активностью мевалонатного метаболического пути и ключевого фермента этого пути — 3-гидрокси-3-метилглютарIL-коэнзим А редуктазы (ГМГ-КоА редуктаза). Предположение основано на том, что почти все из перечисленных факторов формирования инфильтратов критически зависят от генерации внутриклеточного пула ряда промежуточных метаболитов мевалонатного пути, в частности, от продукции фарнезила и геранилгеранила, необходимых для посттрансляционной модификации/активации большого количества белков, включая Rho ГТФазы и другие малые G-белки. Последние играют ключевую роль в передаче сигналов с клеточной поверхности, в перестройках цитоскелета, локомоции и хемотаксисе Мн-Мф, в клеточной адгезии, межклеточных взаимодействиях, секреции хемоаттрактантов, в дифференцировке и активации мононуклеарных фагоцитов [2, 8, 10]. Кроме того, метаболиты мевалонатного пути абсолютно необходимы для пролиферативной реакции клеток, формирующих воспалительные инфильтраты [3]. Известно, что экспрессия и активность ГМГ-КоА редуктазы при воспалении резко возрастает [6]. Логично думать, что индуцибельность ГМГ-КоА редуктазы может в большой степени определять выраженность гранулематозного воспалительного ответа.

Важную роль в гранулемогенезе играют провоспалительные медиаторы и цитокины, формирующие хемокин-цитокиновую сеть [4]. Например, нейтрализация TNFα или IL-1β приводит к подавлению продукции моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (MCP-1) и к нарушению гранулемообразования [7]. Существует большое количество работ, демонстрирующих антивоспалительные эффекты ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы [11, 15]. Поэтому вполне вероятно, что при гранулемогенезе высокая индуцибельность ГМГ-КоА редуктазы может быть сопряжена с повышенной продукцией про- и пониженной продукцией антивоспалительных медиаторов и цитокинов, тогда как низкая индуцибельность ГМГ-КоА редуктазы — с обратной зависимостью.

Целью настоящей работы была проверка предположения о взаимосвязи индуцибельности ГМГ-КоА редуктазы, с одной стороны, и реактивности мононуклеарных фагоцитов и выраженности гранулемогенеза — с другой. Для проверки данного предположения использовали модели неиммунного гранулематозного воспалительного ответа у инбредных мышей пяти разных линий, существенно отличающихся по индуцибельности ГМГ-КоА редуктазы.

Материалы и методы

Животные и модели in vivo. Гранулематозное воспаление вызывали введением фиброгенных и нефиброгенных провоспалительных агентов (соответственно, частиц двуокиси кремния и зимозана) у мышей линий C57Bl/6, C57BR, CBA/Lac, BALB/c, и C3H/F, в ряду которых индуцибельность ГМГ-КоА редуктазы максимальна у линии C57Bl/6, в меньшей степени индуцибельна у C57BR, в еще меньшей — у CBA/Lac, очень низка у BALB/c и минимальна у C3H/F [5, 9]. Для постановки моделей использовали мышей-самцов весом 20–25 г, которым за 3, 5, 7, 9, 13, 25 и 45 суток до забора биологических образцов внутривенно однократно вводили корпускулярный дрожжевой полисахарид из Saccharomyces cerevisiae — зимозан А (Sigma Chemical Co. St.Louis, MO, USA) в виде 2 % суспензии на физиологическом растворе в дозе 50 мг/кг, либо, за 1, 2, 3 и 4 месяца — 2 % суспензию частиц кристаллической силики S-5631 (размер 80 % частиц 1–5 мкм, Sigma) в дозе 100 или 200 мг/кг массы тела. Части животных частицы SiO2 вводили однократно подкожно: дорсально позади шейной области, в виде 10 % суспензии в дозе 500 мг/кг за 3, 5 и 14 дней до оценки гранулемогенного ответа.

Гистоморфометрическое исследование. Выраженность зимозан (Z)- и SiO2-индуцированной гранулематозной инфильтрации позволяет судить о миграции/рекрутировании в гранулемы мононуклеарных фагоцитов — основных клеточных элементов обоих типов гранулем. Межлинейные различия данной активности моноцитов-макрофагов (Мн-Мф) оценивали в динамике гранулемогенеза путем морфометрии окрашенных гематоксилином-эозином гистологических срезов печени и легких по выраженности развития Z- или SiO2-индуцированных фокусов мононуклеарной инфильтрации, определяя объемную и численную плотность инфильтратов, а в случае подкожного введения SiO2, определяя средний размер формирующихся подкожных инфильтратов. Выраженность фиброзных изменений оценивали по величине депозитов коллагена, выявлявшихся окраской с пикросириусом красным. При морфометрии объемную плотность (Vv) определяли, пользуясь окулярной вставкой с бескраевой регулярной тестовой решеткой, определяя количество узлов решетки, случайным образом проецируемых на объект; численную плотность (Nv) оценивали по среднему количеству объектов, приходящихся на поле решетки [1]. Динамику развития гранулем регистрировали от момента инициации гранулемообразования до полной инволюции инфильтратов.

Оценка миелопоэтического ответа в костном мозге. Межлинейные различия активности миелопоэза оценивали в костном мозге у мышей линий C3H/F, BALB/c, CBA/Lac и C57Bl/6 через 1 месяц после введения частиц двуокиси кремния. Оценку проводили с помощью теста колониеобразования in vitro по числу гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц (КОЕ-ГМ), сформированных в полутвердой среде MethoCult (Stemcell Technologies), содержащей 1 % метилцеллюлозу, 15 % фетальную бычью сыворотку (ФБС), 1 % бычий сывороточный альбумин, 10-4 М 2-меркаптэтанола, 200 мг/мл трансферрина, 10 мкг/мл инсулина, 2 мМ L-глутамина и рекомбинантные мышиные факторы роста: 50 нг/мл фактор стволовых клеток (SCF), по 10 нг/мл IL-3 и IL-6, и 3 ЕД/мл эритропоэтина. Постановку теста осуществляли согласно инструкции производителя. Клетки костного мозга получали в стерильных условиях на холоде промыванием полости бедренной кости 0,5 мл среды RPMI-1640, содержащей 2 % ФБС, с последующим ресуспендированием и определением общей численности клеток. Полученные суспензии клеток костного мозга разводили питательной средой MethoCult до концентрации 2×104 клеток/мл, высаживали в трипликатах в чашки Петри диаметром 35 мм, инкубировали при 37 °C и ≥95 % влажности в атмосфере 5 % CO2 + 95 % воздуха. Численность КОЕ-ГМ, содержащих >50 клеток, подсчитывали на 9-й день инкубации.

Оценка продукции цитокинов в культуре перитонеальных макрофагов. Перитонеальные Мф мышей разных линий вызывали внутрибрюшинным введением 4 % гидратированного 1,4-α-гликана за 3 суток до забоя; клетки выделяли из перитонеальной лаважной жидкости методом прилипания к подложке и далее культивировали при 37 °С, 5 % СО2, и 100 % влажности в количестве 250 тыс./лунку в 24-луночных планшетах Linbro в бессывороточной питательной среде RPMI1640, содержащей 2 мМ HEPES, 2 мM L-глутамин и смесь антибиотиков для культивирования клеток (MP Biomedicals) в присутствии или в отсутствие SiO2 в количестве 100 частиц на клетку. Монослои культивировали в течение 24 часов, затем инкубационную среду собирали, замораживали при -20 °С и хранили несколько суток до измерения содержания цитокинов. Содержание цитокинов определяли твердофазным иммуноферментным методом с помощью наборов фирмы Biosource (США) согласно инструкции производителя; для измерений использовали микропланшетный ридер ELx808TM BioTek (США).

Оценка продукции окиси азота в культуре перитонеальных макрофагов. Сравнительную оценку продукции макрофагами мышей разных линий окиси азота проводили в инкубационной среде монослоев перитонеальных Мф, культивированных в течение 48 часов в тех же условиях, что и для определения цитокинов. Продукцию NO оценивали по аккумуляции нитритов колориметрическим методом с реагентом Griess, который готовили как смесь равных объемов 1 % сульфаниламида (Sigma) в 30 % уксусной кислоте и 0,1 % N-[1-нафтил]-этилендиамин дигидрохлорида (Sigma) в 60 % уксусной кислоте. Аликвоты культуральных супернатантов по 100 мкл смешивали с равным количеством реагента в 96-луночных плоскодонных микропланшетах Linbro, инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 минут и далее с помощью микропланшетного ридера при длине волны 570 нм измеряли светопоглощение. Контролем служила такая же культуральная среда, инкубированная в отсутствие клеток. Концентрацию нитритов подсчитывали, используя в качестве стандартной калибровочной кривой последовательные разведения 1 мМ раствора нитрита натрия в среде RPMI1640 (2–250 мкМ).

Статистическую обработку данных проводили согласно общепринятым методам вариационной статистики с определением среднего арифметического и стандартной ошибки средней величины, статистическую значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление