Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2013, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2013

Гипотеза противоопухолевого механизма действия белка теплового шока Hsp70

М.А. Шевцов, И.В. Гужова, Б.А. Маргулис

Молекулярные шапероны, в особенности белок теплового шока Hsp70, способны активировать как врожденный, так и приобретенный противоопухолевый иммунный ответ организма. Мы изучили один из возможных механизмов действия белка. Оценивали распределение очищенного рекомбинантного белка теплового шока Hsp70, меченного флуоресцентным агентом, при внесении его в различные клеточные культуры (меланома В16, глиома С6, клетки эритробластной лейкемии К562), а также влияние этого процесса на повышение чувствительности клеток к цитотоксическому действию лимфоцитов. Оказалось, что при внесении в клеточную культуру Hsp70 способен проникать внутрь клеток, вытесняя при этом собственный внутриклеточный шаперон Hsp70 на поверхность клеточной мембраны. Этот процесс ассоциировался с повышением литической активности естественных киллеров на 35–40 % в зависимости от концентрации вносимого белка, типа клеток и времени предварительной инкубации шаперона с раковыми клетками. Экзогенный Hsp70 приводил также к вытеснению внутриклеточного шаперона во внеклеточную среду, что было подтверждено методом иммуноблоттинга. По результатам исследований in vitro предложена новая гипотеза противоопухолевого действия шаперона Hsp70. (Цитокины и воспаление. 2013. Т. 12. № 1–2. С. 38–44.)

Ключевые слова: белок теплового шока, Hsp70, молекулярные шапероны.

Молекулярные шапероны, как было показано многочисленными исследователями, стимулируют не только врожденный, но и приобретённый противоопухолевый ответ организма [12]. Впервые иммунологическая функция шаперонов была открыта, когда аутологичные шапероны, выделенные из опухоли, вызывали протективный иммунитет к данному типу рака [11]. Позже было продемонстрировано, что выделенные из опухоли шапероны могут связывать опухолевые антигены и доставлять их в антиген-презентирующие клетки с последующей презентацией в комплексе с MHC I или II классов и развитием адаптивного ответа [4]. Однако стоит отметить, что сами шапероны обладают пептид-независимой иммунологической активностью, проявляя функцию цитокина («шаперокин», по A. Asea) [1, 15]. Так, Hsp70 способен активировать цитолитическую и миграционную активность натуральных киллеров (NK-клетки) [5]. При связывании со специфическими рецепторами TLR-2/TLR-4 на поверхности дендритных клеток Hsp70 индуцирует экспрессию костимулирующих молекул (B7.1/B7.2, CD40, CD83, CD86, MHC II класса), созревание дендритных клеток и секрецию ими провоспалительных цитокинов (таких, как TNFα, IL-1β, IL-6, IL-12, GM-CSF) [2]. Так, в серии экспериментов in vivo Ito и соавт. продемонстрировали, что локальное внутриопухолевое введение Hsp70 приводит к задержке опухолевого роста [6].

Несмотря на появление в мировой литературе новых данных успешного применения белков теплового шока в адьювантной терапии раковых заболеваний [13, 14], вопрос о механизмах иммуномодулирующего действия шаперонов остается открытым. Предложенная концепция «шаперокинного» стимулирующего влияния Hsp70 на клетки иммунной системы лишь отчасти объясняет противоопухолевый эффект очищенного белка Hsp70 в случае локального интратуморального введения. В серии экспериментов in vitro мы поставили перед собой задачу изучить взаимодействие очищенного рекомбинантного шаперона Hsp70 с различными раковыми клетками и оценить влияние этих процессов на противоопухолевую активность лимфоцитов.

Материалы и методы

Препарат очищенного человеческого рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 был получен из экстракта E. coli, трансформированных плазмидой pMSHsp70. Hsp70 выделяли при помощи метода ионно-обменной хроматографии с применением DEAE-Sepharose (GE Healthcare) с последующей АТФ-аффинной хроматографией с применением АТФ-агарозы (Sigma, USA). Примесь бактериального эндотоксина удаляли при помощи геля полимиксина-В (Sigma, USA). Оценка количества липополисахарида (ЛПС) в растворе очищенного белка осуществляли с помощью теста LALA E-Toxate (Sigma Aldrich, USA). В конечном растворе белка содержание эндотоксина было ниже 0,5 EU/мг.

Для оценки распределения экзогенного белка Hsp70 при внесении в клеточную культуру мы пометили последний флюоресцентым агентом Alexa555 (Invitrogen, USA) по методике, предложенной фирмой-производителем. Далее шаперон добавляли в клеточную среду на разные временные интревалы: для клеток мышиной меланомы В16 и клеток крысиной глиомы С6 время инкубации составило 1, 3, 6 и 18 часов; для клеток эритроидной лейкемии человека К562 – 3 и 6 часов. За 20 минут до окончания инкубации в клеточную среду добавляли раствор DAPI (разведение 1:2000) для окрашивания ядер клеток. По окончании инкубации клетки отмывали от белка и фиксировали 1 % раствором параформальдегида в течение 30 минут. После этого обрабатывали моноклональными антителами (разведение 1:500) к поверхностному белку теплового шока Hsp70. В качестве первичных антител к индуцибельной (Hsp70) и конститутивным (Hsc70) формам шаперона Hsp70 применяли следующие антитела: BRM-22a (Sigma, USA) (к индуцибельной и конситутивным формам), SPA815 (Stressgen, USA) (к конститутивной форме). Далее клетки обрабатывали вторичными антителами (разведение 1:1000), меченными Alexa488 (Invitrogen, USA). По окончании инкубации клетки заключали под покровное стекло в смолу DAKO (Dako North America Inc., USA) для флюоресцентой микроскопии и анализировали на конфокальном микроскопе Leica TCS SP2 с применением стандартных масляных иммерсионных объективов HCX PL APO 100×1.40 NA, HP 40×1.25. Анализ происходил на длинах волн возбуждения 488 нм (Ar/Kr), 405 нм (diode laser), 543 нм (гелий-неоновый лазер).

Для оценки выхода эндогенного белка Hsp70 во внеклеточную среду под действием экзогенного белка мы инкубировали клетки крысиной глиомы С6 (15×106 клеток на каждую пробу) с рекомбинантным белком Hsp70, коньюгированным с биотином (концентрация 50 мкг/мл), в течение 30 минут, 3, 6 и 18 часов (рис. 1). Коньюгирование с биотином проводили по стандартной методике. Далее клетки отмывали раствором фосфатно-солевого буфера и помещали в безсывороточную среду на 90 минут. После осаждения клеток центрифугированием (800 об./мин, 5 мин) в супернатант добавляли раствор 0,1 % Tween-20 для разрушения возможных экзосом, а также буфер Tris-HCl (pH=7,5) и MgCl2 в конечной концентрации 20 мМ и 5 мМ, соответственно. Далее в супернатант вносили гель стрептавидин-сефарозы (Sigma, USA). Инкубацию проводили в течениe ночи при температуре +4 °С. После инкубации пробы центрифугировали, и в супернатант вносили гель АТФ-агарозы. После инкубации в течение ночи при +4 °С гель осаждали центрифугированием. К осадку добавляли 20 мМ Tris-HCl (pH=7,5), 5 мМ MgCl2, 0,5 M NaCl и смешивали с двукратным буфером для электрофореза (содержащим 5 % SDS и 30 мМ 2-меркаптоэтанола). Далее – нагревание в течение 5 мин при температуре 95 °С и осаждение геля центрифугированием. Пробы наносили на полиакрилаамидный гель для электрофореза с последующим иммуноблоттингом. Hsp70 выявляли поликлональными антителами RS-II собственного приготовления (1:500) либо avidin-peroxidase (1:10000). Указанное двукратное внесение в клеточную среду сначала стрептавидин-сефарозы, а затем АФТ-агарозы производилось с целью дифференциального определения того, какая форма Hsp70 (экзогенная либо внутриклеточная) в динамике выходит во внеклеточную среду.

Оценку влияния экспрессируемого на поверхности раковых клеток белка Hsp70 на противоопухолевую цитолитическую активность NK-клеток производили в тесте цитотоксической активности лимфоцитов (ЦТЛ-тест). Цитолитическую активность лимфоцитов на опухолевые клетки определяли по количеству выхода фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в среду в результате цитолиза раковых клеток. Количество ЛДГ в супернатанте определяли при помощи набора Cytotox96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, USA). Расчет литической активности лимфоцитов проводили по протоколам фирмы-производителя. В качестве лимфоцитов использовались спленоциты крыс или мышей (соответственно, для линии клеток крысиной глиомы С6 или мышиной меланомы В16), либо лимфоциты периферической крови здоровых доноров (в случае клеток лейкемии человека К562), выделенных по стандартной методике на градиенте плотности Histopaque®-1.077 (Sigma, USA). Вкратце, выделенные лимфоциты (эффекторные клетки) добавляли к клетками-мишеням (глиома С6, меланома В16, К562) в 96-луночной плате в титрах 25:1, 50:1, 100:1. Плату инкубировалиь в течение 4 час при температуре 37 °С, 5 % СО2. Далее после центрифугирования плат производили забор 50 мкл аликвот из каждой лунки и переносили их в чистую 96-луночную плату, в которую затем последовательно вносили раствор субстрата и старт-реактив. Платы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего вносили по 50 мкл стоп-реактива в каждую лунку. Уровень оптической плотности измеряли при длине волны 492 нм на планшетном фотометре, и далее по формуле для каждого соотношения «эффекторные клетки:клетки-мишени» определяли процент цитотоксической активности спленоцитов.

Оценку достоверности различий меду группами производили с использованием t-критерия Стьюдента. Статистически достоверным различие признавалось при p<0,05. Результаты исследования представлены в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (M±m). Статистическую обработку материала осуществляли с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows (версия 8).

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление