Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2013, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2013

Функциональные типы ответа NK-клеток на действие интерферона альфа у пациентов с часто рецидивирующим простым герпесом

А.В. Карсонова, А.Е. Шульженко, А.В. Караулов

Цитотоксическая активность NK-клеток и интерфероны (IFN) I типа являются одними из главных факторов защиты организма от вирусов, в том числе герпетических. IFN I типа являются мощными активаторами цитотоксичности NK-клеток. Препараты рекомбинантного IFN и индукторы IFN широко используются как с лечебной, так и с профилактической целью, однако не у всех пациентов препараты данной группы одинаково эффективны. Целью данной работы стало изучение особенностей ответа NK-клеток на влияние IFNα при часто рецидивирующем простом герпесе (ЧРПГ). Мы обнаружили, что пациенты с ЧРПГ являются гетерогенной группой по показателям всистеме «цитотоксичность NK-клеток/IFN I типа» и идентифицировали два иммунопатогенетических варианта ЧРПГ. В ремиссию пациенты группы А имели нормальные показатели исходной NK-активности и достоверно сниженные IFN-стимулированные показатели. Другими словами, группа А в ремиссию имела снижение «чувствительности» NK-клеток к IFNα. В обострение статистически значимых отличий между группой А и донорами не наблюдалось. Пациенты группы В, напротив, имели нормальную «чувствительность» NK-клеток к IFNα в ремиссию, а вот обострение сопровождалось выраженным иммунодефицитом в виде втрое сниженной NK-активности как исходной, так и IFN-стимулированной. При проведении иммунокорригирующей терапии необходим персонифицированный подход с учетом патогенетического варианта, определяемого на основании особенностей ответа NK-клеток на IFN. (Цитокины и воспаление. 2013. Т. 12. № 1–2. С. 52–56.)

Ключевые слова: NK-клетки, дегрануляция, NK-активность, рецидивирующий простой герпес, цитотоксичность, CD107a, проточная цитометрия, интерферон альфа.

Цитотоксическая активность NK-клеток является одним из главных факторов защиты организма от вирусов, в том числе герпетических. Эта активность осуществляется клетками путем образования иммунологического синапса между NK-клеткой и клеткой–мишенью [5]. В результате образования этого синапса происходит дегрануляция NK-клеток, проявляющаяся в слиянии мембраны цитолитических гранул с цитоплазматической мембраной клетки и выделении цитолитических белков гранзима и перфорина, разрушающих клетку–мишень. Маркером цитолитических гранул является белок CD107a (LAMP-1) [3]. Цитотоксический эффект NK-клеток существенно, но не полностью зависит от интенсивности дегрануляции. Процесс дегрануляции выявляют путем идентификации на поверхности NK-клеток маркера цитолитических гранул CD107a c помощью моноклональных антител в проточной цитометрии. Одним из мощных стимуляторов цитотоксической активности NK-клеток является IFNα, который широко применяется для лечения различных вирусных инфекций.

Стандартом фармакотерапии пациентов с часто рецидивирующим простым герпесом (ЧРПГ) является эпизодическая или супрессивная терапия ациклическими нуклеозидами. Однако монотерапия противовирусными препаратами зачастую не позволяет добиться контроля над инфекцией. Согласно клиническим рекомендациям, при отсутствии эффекта от лечения рекомендуется назначение других препаратов или методик лечения [2]. По мнению многих авторов оптимальной является только комплексная терапия, сочетающая этиотропное лечение ациклическими нуклеозидами и патогенетическое лечение иммуномодулирующими препаратами. В качестве других препаратов и методик в последнее время успешно применяются препараты рекомбинантного IFNα и индукторы IFNα как с лечебной, так и с профилактической целью, однако не у всех пациентов препараты данной группы одинаково эффективны. Целью данной работы было изучение особенностей ответа NK-клеток на влияние IFNα при часто рецидивирующем простом герпесе (ЧРПГ).

Материалы и методы

Пациенты и доноры. Под наблюдением находились 48 пациентов (9 мужчин, 39 женщин) в возрасте 44 (29–63) лет с верифицированным диагнозом ЧРПГ. В исследование были включены пациенты с генитальной локализацией процесса (n=31), с лабиальной локализацией (n=10) и смешанной локализацией (n=7). Длительность заболевания у большинства пациентов (n=40) составляла более 5 лет, у остальных (n=8) — от 2 до 4 лет. Частота обострений на момент обследования была 6 и более раз в год. В стадию обострения (в пределах 48 ч с момента появления высыпаний) исследованы 35 человек; из них 18 исследованы также в стадию ремиссии (более 2 недель с момента появления высыпаний). 13 человек исследованы только в стадию ремиссии.

Контрольную группу составили 32 здоровых донора в возрасте 36,5 (22–57) лет, из них 13 мужчин и 19 женщин, давших добровольное письменное согласие на участие в исследование согласно форме, одобренной Межвузовским комитетом по этике при Ассоциации медицинских и фармацевтических работников. Критериями включения в группу контроля являлось отсутствие острых и хронических инфекционных и воспалительных заболеваний, в том числе РПГ, в течение как минимум 1 месяца до момента взятия крови.

От всех исследуемых получали 15 мл венозной гепаринизированной крови.

Стимуляция мононуклеарных клеток (МНК) IFNα. МНК выделяли из венозной крови на градиенте плотности фиколла–урографина, отмывали средой 199 и ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС), которая представляла собой среду RPMI с добавлением 10 % фетальной телячьей сыворотки (ФТС) и 2 мМ L-глутамина (ООО НПП «ПанЭко», Россия). МНК культивировали в полипропиленовых пробирках (2×106/мл/пробирку) в присутствии рекомбинантного человеческого IFNα2b (Invitrogen, Great Britain) в концентрации 10, 100 и 1000 ЕД/мл в течение 24 ч в СО2-инкубаторе (5 % СО2, 37 °С). Контрольные клетки культивировали без IFNα. Через 24 ч МНК отмывали и ресуспендировали в ПКС для исследования дегрануляции NK-клеток и NK-активности.

Исследование дегрануляции NK-клеток. Дегрануляцию NK-клеток, культивированных 24 ч с IFNα или без него, оценивали с помощью проточной цитометрии по экстернализации маркера CD107a. Использовали методику, подробно описанную ранее, c некоторыми изменениями: 1) вместо FITC-меченных моноклональных антител к CD107a использовали PC5-меченные (BD Pharmingen, USA); 2) поскольку метка PC5 нечувствительна к pH, то моненсин, использованный ранее для ингибирования закисления эндосом, не добавляли [1, 4]. В качестве индуктора дегрануляции использовали клетки K562 (соотношение МНК : K562 = 1 : 1). Результаты представляли как процент CD107a+ NK-клеток по отношению ко всем CD3CD56+ NK-клеткам после инкубации без индукторов дегрануляции и с клетками K562. Рассчитывали следующие параметры:

Дегрануляция NK-клеток = [% CD107a+ NK-клеток в присутствии клеток K562] – [% CD107a+ NK-клеток в отсутствие индукторов дегрануляции] при данной концентрации IFNα.

Исследование NK-активности МНК. NK-активность МНК, культивированных 24 ч с различными концентрациями IFNα, исследовали методом проточной цитометрии по киллингу клеток-мишеней K562, меченных CFSE (5,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидиловым эфиром) по методике, подробно описанной ранее [1, 4]. Использовали соотношение эффектор : мишень, равное 50 : 1. NK-активность рассчитывали по формуле:

% погибших мишеней в опыте – % спонтанной гибели

NK-активность = ————————————————————————— × 100 %.

100% – % спонтанной гибели

Статистическая обработка данных. Все данные представлены как медиана (10-й–90-й процентиль). Статистическую обработку данных проводили с помощью программы SPSS 11.5 для Windows. Для оценки достоверности различий между двумя группами использовали критерий Манна — Уитни (U-тест).

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление