Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2013, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2013

Сравнение паттерна экспрессии мРНК цитокинов в эпителиальных клетках A-549, инфицированных вирусами гриппа A/H1N1pdm09, А/H3N2 и А/H5N1

М.А. Плотникова, А.В. Васин, С.А. Клотченко, Т.Д. Смирнова, Д.М. Даниленко, В.В. Егоров, А.-П.С. Шурыгина, О.И. Киселев

Профиль экспрессии цитокинов является важной характеристикой протекания вирусной инфекции. Разработана тест-система на основе количественной мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени для определения экспрессии мРНК 9 цитокинов: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12β, IL-18, IFNγ и TNFα. С ее помощью определили паттерн экспрессии мРНК вышеприведенных цитокинов в эпителиальных клетках A-549, инфицированных вирусами гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm) и A/Victoria/361/11(H3N2) человека и A/курица/Kurgan/5/05(H5N1) птиц. Вирусы гриппа ожидаемо вызывали индукцию провоспалительных цитокинов в клетках А-549, при этом для вируса А/H5N1 уровни экспрессии мРНК цитокинов IL-1β и IL-6 были значимо выше. мРНК антивоспалительного цитокина IL-4 обнаружили в клетках A-549, инфицированных только штаммами A/California/07/09 и A/Victoria/361/11 преимущественно в высоких дозах, но не штаммом A/курица/Kurgan/5/05. Кроме того, показали, что белок NS1 вируса гриппа напрямую или опосредованно отвечает за экспрессию антивоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 в клетках А-549, так как делеция гена NS приводила к подавлению экспрессии мРНК IL-4 и активации экспрессии мРНК IL-10. (Цитокины и воспаление. 2013. Т. 12. № 1–2. С. 57–65.)

Ключевые слова: цитокины, ПЦР, вирус гриппа.

Грипп — это острое респираторное инфекционное заболевание, этиологическим агентом которого являются одноименные РНК-содержащие вирусы семейства Orthomyxoviridae. Вирусы гриппа выработали в процессе эволюции различные механизмы противодействия иммунной системе организма хозяина, важными медиаторами которой на местном уровне являются молекулы цитокинов [2, 11]. На первом этапе противовирусного иммунного ответа организма происходит, в частности, активация интерферон-опосредованных факторов врожденного иммунитета. Иммунокомпетентные клетки начинают продуцировать провоспалительные цитокины, такие как IL-1, IL-2, TNFα и IL-6, что приводит к разрушению инфицированных вирусом гриппа клеток под действием макрофагов и натуральных киллерных (NK)-клеток [11]. Далее первичный иммунный ответ, направленный на элиминацию вируса, запускает механизмы поддержания гомеостаза, важная роль в регуляции которых принадлежит антивоспалительным цитокинам, таким как IL-10 и IL-4 [11].

В целом, баланс между про- и антивоспалительными цитокинами является определяющим в развитии всего противовирусного ответа. Однако в некоторых случаях может происходить сбой врожденного иммунного ответа, приводящий к подавлению адаптивного иммунитета и избыточному синтезу цитокинов. Процесс нарушения баланса цитокинов получил название «цитокиновый шторм». Так, анализ причин смертности от патогенных вирусов гриппа А (ВГА), таких как A/H5N1, A/H1N1(1918) и A/H7N7, показал, что поражения в дыхательной системе и внутренних органах были во многом связаны именно с гиперпродукцией цитокинов [7].

Как правило, в клинических исследованиях анализ цитокинового статуса сводится к прямому измерению нескольких цитокинов в периферической крови. При этом не учитывается весь иммунный каскад в контексте инфицирующего патогена и быстро изменяющегося иммунного окружения в тканях. При поражениях тканей респираторного тракта, вызванных тяжелыми инфекциями (например, гриппом птиц А/H5N1), решающая роль в развитии иммунопатологии, вероятно, принадлежит иммунному ответу, имеющему место именно в тканях, а не тем цитокинам, уровень которых обычно измеряется в периферической крови [11]. Таким образом, создание методов, позволяющих оценивать экспрессию мРНК цитокинов в клетках и тканях при гриппе, является важной и актуальной задачей.

Ранее авторами был предложен метод оценки экспрессии мРНК цитокинов с помощью олигонуклеотидного микрочипа [1]. В данном исследовании предложена разработка тест-системы на основе количественной мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени для определения экспрессии мРНК 9 цитокинов: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12β, IL-18, IFNγ и TNFα. С помощью этой системы определили паттерн экспрессии мРНК вышеприведенных цитокинов в эпителиальных клетках линии A-549, инфицированных вирусами гриппа A/H1N1pdm09 и А/H3N2 человека и А/H5N1 птиц.

Материалы и методы

Культивирование клеток. В качестве модели интерферон-компетентных клеток использовали перевиваемую клеточную линию аденокарциномы легкого человека А-549. Клетки культивировали в среде DMEM (Invitrogen, USA), содержащей 10 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Invitrogen, USA) и 1 % смеси антибиотиков (пенициллин, стрептомицин) при 37 °C и 5 % CO2.

Вирусы. В работе использовали штаммы ВГА подтипов A/H1N1pdm09 (A/California/07/09) и A/H3N2 (A/Victoria/361/11) человека и подтипа A/H5N1 (A/курица/Kurgan/5/05) птиц. Представленные в работе штаммы подтипов A/H1N1pdm09 и A/H3N2 рекомендованы ВОЗ в качестве кандидатов в вакцинные на 2013 год [12, 13]. Кроме того, для оценки роли белка NS1 ВГА в развитии иммунного ответа использовали 6:2 реассортантные штаммы вируса гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1) wtNS1 и ΔNS1, у одного из которых была удалена открытая рамка считывания гена NS1 в сегменте NS, как описано у García-Sastre A. и др. [4]. Эти реассортанты были получены методом обратной генетики на основе штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). От вируса A/Kurgan/5/05 (H5N1) в них представлены гены, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу.

Стимуляция клеток. Для анализа продукции цитокинов исследуемые вирусы вносили в клеточные культуры (105–106 клеток/мл) с множественностью заражения (MOI) 0,01, 0,1 и 1. После 30 минут инкубации при комнатной температуре клетки отмывали от вирусных частиц и ресуспендировали в 1 мл чистой культуральной среды. Анализ паттернов экспрессии мРНК цитокинов проводили через 0,5, 4, 8, 12 и 24 часа инкубации при 37 °C и 5 % СО2.

Проведение реакции обратной транскрипции. Тотальную клеточную РНК выделяли с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, USA). Концентрацию и степень чистоты оценивали спектрофотометрически на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, USA). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием 1 мкг тотальной РНК и универсального праймера олиго (дТ)16 (ДНК-Синтез, Россия) в объеме 25 мкл при 37 °C в течение 1 часа. Кроме праймеров и РНК, смесь для обратной транскрипции содержала 500 мкМ дНТФ, 200 единиц M-MLV ревертазы, 5× M-MLV реакционный буфер, 25 единиц ингибитора рибонуклеаз RNasin (Promega, USA).

Проведение мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени. ПЦР проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 1× Taq-буфер, 4 мМ MgCl2, 2,5 единицы Taq-полимеразы (Медиген, Россия), 330 мкM дНТФ (Promega, USA), 2 мкл кДНК, прямые и обратные праймеры и олигонуклеотидные TaqMan зонды для количественного определения экспрессии мРНК цитокинов и нормировочной мРНК, кодируемой геном глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (GAPDH). Последовательности праймеров и зондов были подобраны в ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, синтезированы в компании «ДНК-Синтез» (Россия), а их количественное соотношение в реакционной смеси (от 0,15 мкМ до 0,85 мкМ) было оптимизировано экспериментально. ПЦР проводили в амплификаторе CFX-96 (Bio-Rad, USA) по следующей программе: 95 °С — 4 минут; 40 циклов 95 °С — 30 с, 57 °С — 30 с, 72 °С — 60 с с детекцией по четырем каналам: FAM, HEX, ROX и Cy5.

Определение вирусной нагрузки методом ПЦР. Для определения вирусной нагрузки использовали рекомендованные CDC (Центры по контролю и профилактике заболеваний США) праймеры InfA, разработанные для выявления всех подтипов ВГА. Смесь для ПЦР содержала 1× Taq-буфер, 4 мМ MgCl2, 2,5 единицы Taq-полимеразы (Медиген, Россия), 330 мкM дНТФ (Promega, США), по 0,67 мкМ прямого 5′-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3′ и обратного 5′-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3′ праймеров и 0,17 мкМ олигонуклеотидного TaqMan зонда 5′-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3′. Реакцию проводили в амплификаторе CFX-96 (Bio-Rad, USA) по следующей программе: 95 °С — 3 минут, 40 циклов 95 °С — 30 с, 55 °С — 30 с, 72 °С — 30 с с детекцией по каналу FAM. Типирование и субтипирование вирусов гриппа, помимо традиционного метода ПЦР, было также подтверждено с помощью экспериментальной тест-системы «Биогрипп» (ЗАО «ИмДи», ИМБ РАН, Россия).

Анализ полученных данных. Расчет относительной экспрессии цитокинов IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12β, IL-18, IFNγ и TNFα проводили с использованием дельта-дельта Ct (ΔΔCt) метода, используя GAPDH в качестве нормировочного гена. Все реакции проводили в повторах, с использованием двух биологических реплик. Относительный уровень экспрессии гена рассчитывали по индуктивной формуле 2-[ΔΔCt] (группой контроля были интактные клетки через 24 часа инкубации) [8].

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление