Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2014, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2014

Влияние беталейкина на показатели антигенспецифического иммунного ответа в модельных опытах иммунизации животных живой чумной вакциной

Т.С. Пономарёва, П.Н. Дерябин, Б.В. Каральник, Т.Г. Денисова, Т.И. Тугамбаев, Б.Б. Атшабар, С.Б. Закарян, Н.Н. Мельникова

Цель исследования — оценка влияния беталейкина (БЛ, рекомбинантного IL-1β) на иммуногенную и протективную активность живой чумной вакцины в модельных опытах на животных. Опыты проведены на кроликах, иммунизированных живой чумной вакциной EV, и морских свинках, иммунизированных этой же вакциной, с последующим заражением вирулентным штаммом Y. pestis 231. Влияние БЛ на антигенспецифический иммунный ответ оценивали по выявлению лимфоцитов с рецепторами к F1 антигену Y. pestis (ЛфР) методом адгезии и титру гомологичных антител в реакции непрямой гемагглютинации. Влияние на протективную активность оценивали по количеству павших морских свинок в группах с и без использования БЛ. При иммунизации кроликов вакциной EV с БЛ быстрее появлялись и исчезали ЛфР, и быстрее и интенсивнее развивался антительный ответ. Это свидетельствует о том, что БЛ стимулировал как раннюю фазу антигеспецифического иммунного ответа, ускоряя появление и исчезновение ЛфР, так и антительный ответ (эффекторная фаза). Сочетанное использование живой чумной вакцины и БЛ существенно повышало и протективную активность вакцины в модельных опытах на морских свинках. Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что применение рекомбинантного интерлейкина 1β в комплексе с вакциной EV является перспективным путем повышения ее эффективности. (Цитокины и воспаление. 2014. Т. 13. № 1. С. 57–62.)

Ключевые слова: беталейкин, живая чумная вакцина, антигенспецифический иммунный ответ, модельные опыты на животных.

Интерлейкин 1β (IL-1β), провоспалительный цитокин, был впервые описан в 1985 г. [9]. Сегодня этот цитокин, широко применяемый при лечении различных заболеваний в качестве иммуномодулятора беталейкина (БЛ), повышающего активность нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов, используется и для стимуляции иммунного ответа к различным вакцинам [3]. Однако его применение в качестве иммуномодулятора при вакцинации (иммунизации) людей или животных весьма ограничено [5, 10]. В то же время именно наличие в живой вакцине компонента, определяющего синтез и секрецию этого ключевого, инициирующего иммунный ответ цитокина, определяет эффективность вакцины [4]. В эксперименте и при лечении больных герпесом в период обострения показано, что введение БЛ на фоне использования лечебной герпетической вакцины оказывало иммуномодулирующий эффект на раннюю и эффекторную стадии антигенспецифического иммунного ответа [1, 10].

Применяемая в СНГ, в том числе в Казахстане и России, для профилактики чумы живая вакцина на основе штамма Y. pestis EV, будучи достаточно активной при первичной вакцинации, значительно теряет эффективность при повторных ревакцинациях, т. к. на фоне первично сформированного иммунитета не происходит вторичное приживление живой вакцинной культуры; при этом сохранившегося поствакцинального уровня иммунитета недостаточно для защиты от вирулентных штаммов Y. pestis [8].

Цель настоящей работы — оценка влияния рекомбинантного интерлейкина 1 (БЛ) на иммуногенную и протективную активность живой чумной вакцины в модельных опытах на животных.

Материалы и методы

Вакцина и иммуномодулятор. В работе использована живая чумная вакцина, полученная на основе штамма Y. pestis EV (производства КНЦКЗИ имени Масгута Айкимбаева, г. Алматы, Республика Казахстан), и БЛ (ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, Санкт-Петербург).

Антиген. В качестве антигена, к которому в экспериментах изучали антигенспецифический ответ, был выбран капсульный антиген Y. pestis — F1. F1-антиген получен по методу E.E. Baker [7].

Лимфоциты. Выделение лимфоцитов проводили в градиенте плотности фиколла–верографина, d=1,077 г/см3.

Иммунореагенты. Реагенты для определения лимфоцитов с рецепторами к F1 (ЛфР) были разработаны предварительно.

В качестве сорбента, связывающего F1, применяли фиксированные ацетальдегидом эритроциты быка, спонтанно не связывающиеся с лимфоцитами человека, кролика и морских свинок [2]. Конъюгацию F1 с эритроцитами осуществляли при помощи риванола [6]. Для выбора рабочих доз F1, обеспечивающих оптимальную и субоптимальную чувствительность иммунореагентов, фиксированные эритроциты сенсибилизировали растворами, содержащими F1 в концентрациях от 3,9 до 1000,0 мкг/мл. Приготовленные экспериментальные серии иммунореагентов тестировали на лимфоцитах кроликов, иммунизированных вакциной EV за 15 дней до тестирования, для определения концентраций F1, обеспечивающих оптимальную и субоптимальную чувствительность иммунореагентов при выявлении ЛфР. Иммунореагенты всех 9 экспериментальных серий и одной контрольной (не нагруженные антигеном эритроциты) тестировали параллельно с одной и той же пробой лимфоцитов, выделенных из крови каждого из двух иммунизированных кроликов. Оптимальной чувствительности иммунореагента соответствовала его способность выявлять в пробе лимфоцитов иммунизированных кроликов максимальное количество ЛфР. Иммунореагент, при помощи которого в той же пробе лимфоцитов удавалось выявить примерно половину количества ЛфР по отношению к количеству, определяемому при использовании иммунореагента оптимальной чувствительности, являлся субоптимальным. Испытания позволили определить оптимальную и примерно 50 %-ную, чувствительность иммунореагентов при определении ЛфР — для их приготовления фиксированные эритроциты нужно было нагружать F1 в концентрациях 125 и 25 мкг/мл, соответственно (рис. 1).

В качестве иммунореагента для определения антител к F1 использовали препарат производства КНЦКЗИ имени Масгута Айкимбаева, г. Алматы, Республика Казахстан.

Определение лимфоцитов с рецепторами. ЛфР определяли методом адгезии иммунореагента оптимальной или субоптимальной чувствительности на выделенных лимфоцитах при соотношении 1,2·108 корпускул реагента на 2·106 лимфоцитов. В контроле вместо иммунореагентов специфичности F1 использовали те же эритроциты, не нагруженные F1. После экспозиции выполняли по 7 определений ЛфР специфичности F1 и лимфоцитов, связавших контрольный реагент. ЛфР учитывали как лимфоциты, связывавшие не менее 3 корпускул иммунореагента. ЛфР считали выявленными в пробе лимфоцитов, если их содержание, определенное с тем или иным опытным иммунореагентом, достоверно (p≤0,05) превышало содержание в той же пробе лимфоцитов, связавших контрольный иммунореагент. По этим данным определяли среднее содержание ЛфР в биопробе лимфоцитов. На протяжении всего опыта использовали одну и ту же серию каждого иммунореагента. Содержание ЛфР и лимфоцитов, связавших контрольный реагент в суспензии лимфоцитов, выражали в процентах.

Определение антител. Активность антител к F1 определяли в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при помощи эритроцитарного антигенного диагностикума. Активность антител в сыворотке выражали lg титра РНГА. В каждой индивидуальной сыворотке активность антител определяли в 4-х повторностях, рассчитывая по этим данным среднюю величину lg. За суммарный показатель активности антител принимали величину площади, ограниченной на графике кривой динамики lg титра антител за весь период их выявления. Этот показатель рассчитан как сумма площадей трапеций, каждая из которых ограничена соседними сроками определения антител, отрезком кривой lg титра антител в эти сроки и перпендикулярами из точек на кривой к точкам соответствующих сроков на оси абсцисс. Данный показатель — один из нескольких, позволяющих судить об интенсификации антительного ответа под влиянием различных факторов. На протяжении всего опыта использовали одну и ту же серию препарата для определения антител.

Дизайн опыта. Выполнено две серии опытов. Протоколы проведения опытов (№№ 3–8) были рассмотрены и одобрены на заседании биоэтической комиссии КНЦКЗИ.

Первая серия опытов по оценке влияния БЛ на иммуногенную активность вакцины была выполнена на кроликах, что обеспечило возможность длительного (231 день) отслеживания динамики антител при частом получении крови у животных. В опыт были включены 2 группы по 4 кролика в каждой. Всем животным вводили внутривенно вакцину EV (3×108 клеток) в 0,5 мл 0,85 % раствора натрия хлорида. Одновременно животным опытной группы вводили одноразово БЛ в дозе 0,5 мкг внутривенно в 0,5 мл 0,85 % раствора натрия хлорида; животным контрольной группы вместо БЛ вводили внутривенно 0,5 мл 0,85 % раствора натрия хлорида.

У каждого кролика из краевой вены уха до и через 2, 4, 7, 14, 21, 28, 35 и 42 дня после иммунизации брали кровь в пробирку с гепарином (~4 мл) для выделения лимфоцитов и в сухую пробирку (~1 мл) для получения сыворотки. В дальнейшем (после 42 дней) кровь брали только в сухую пробирку 1 раз в неделю до 231-го дня включительно.

Антигенспецифический ответ (к F1 антигену Y. pestis) оценивали по выявлению лимфоцитов, имевших рецепторы к этому антигену (ЛфР), и гомологичных антител.

Во второй серии опытов влияние БЛ на иммуногенную и протективную активность вакцины изучали в опытах на морских свинках. Морские свинки для этого эксперимента были выбраны потому, что эта модель заражения лабораторных животных является стандартной при выполнении экспериментов с Y. pestis, в частности, при оценке протективной активности чумных вакцин.

Животные опытной группы (23 морские свинки) были иммунизированы вакциной Y. pestis EV (106 микробных клеток) с одновременным внутривенным введением БЛ (0,5 мкг). Животным контрольной группы № 1 (82 морские свинки) вводили внутривенно только вакцину Y. pestis EV (106 микробных клеток). Животным контрольной группы № 2 (10 морских свинок) вводили только БЛ (0,5 мкг). На 21-е сутки после иммунизации (введения БЛ) все животные были заражены вирулентным штаммом Y. pestis 231 в дозе 200 DCI .

Иммуногенную активность оценивали по титру антител к капсульному антигену F1 Y. pestis на 14-й день после иммунизации. Кровь для исследования брали из сердца, сыворотку отделяли стандартным методом.

Протективную активность вакцины и влияние на нее иммуномодуляции оценивали по количеству животных, погибших на 14-й день после заражения. Оставшихся в живых животных умерщвляли путем тотального обескровливания, предварительно усыпив их эфиром.

В работе применяли статистические методы частных сравнений серий. Результат считали значимым при p≤0,05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление