Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2014, № 1

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2014

Особенности цитокинового профиля моноцитов при стимуляции аденозиновых рецепторов in vitro

К.В. Невская, Л.М. Огородова, К.С. Юрьева, Е.Э. Иванюк, О.П. Иккерт, И.В. Салтыкова, А.Э. Сазонов

Проведено исследование цитокинового профиля моноцитов периферической крови здоровых доноров при стимуляции аналогом аденозина NECA в концентрации 30 мкМ, что соответствует ранним стадиям повреждения ткани и гипоксии. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени определены уровни экспрессии мРНК цитокинов, регулирующих воспалительные реакции (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10) и процессы ангио- и фиброгенеза (IP-10, βFGF, TGFβ, VEGF). Иммуноферментным методом определены уровни секреции данных цитокинов. Результаты исследования свидетельствуют об увеличении экспрессии стимулированными моноцитами преимущественно генов провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-8), и цитокинов, регулирующих ангиогенез и фиброгенез (VEGF, βFGF, IP-10). При исследовании секреторной активности стимулированных моноцитов установлено значительное повышение уровня секреции сосудисто-эндотелиального фактора роста. Полученные данные свидетельствуют о том, что стимуляция аденозиновых рецепторов моноцитов в начальные фазы повреждения тканей ведет к активации экспрессии цитокинов, необходимых для санации очага воспаления и стимуляции регенеративных процессов. (Цитокины и воспаление. 2014. Т. 13. № 1. С. 67–70.)

Ключевые слова: аденозин, моноциты, цитокины.

Аденозин — эндогенный пуриновый нуклеозид, высвобождающийся в повышенных количествах при повреждении ткани и в условиях гипоксии. Физиологическая концентрация внеклеточного аденозина не превышает 1 мкМ, однако при выраженных воспалительных процессах и ишемии способна превышать 100 мкМ, так, например, концентрация аденозина в плазме больных сепсисом составляет 4–10, а в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом — 10–100 мкМ [6, 9, 11].

Свои эффекты аденозин реализует через взаимодействие со специфическими рецепторами [2, 4, 5]. В настоящее время секвенировано и клонировано 4 типа аденозиновых рецепторов: А1, А2А, А2В, А3, все они определяются на поверхности цитоплазматической мембраны моноцитов [3, 10].

Стимуляция аденозиновых рецепторов клеток иммунной системы (макрофагов, дендритных клеток, тучных клеток, нейтрофилов, NK-клеток) приводит к изменению уровней экспрессии и секреции цитокинов, увеличению содержания внутриклеточного Ca2+, повышению противоопухолевого иммунитета и т. д. [8].

Поскольку аденозин быстро гидролизуется в организме (около 15 мин при внутривенном введении), в экспериментальной работе применяли неселективный агонист аденозиновых рецепторов 5'-N- этилкарбоксамидоаденозин (NECA), аналогичный аденозину по способности стимулировать аденозиновые рецепторы [10].

Известно, что моноциты являются источником ряда провоспалительных цитокинов (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNFα), вовлеченных в патофизиологию воспалительного процесса [7]. Моноциты мигрируют в очаг воспаления во время острой фазы и обычно преобладают спустя 16–24 ч, достигая пика, как правило, на третьи сутки [1].

Изучение эффектов стимуляции аденозиновых рецепторов моноцитов способствует пониманию молекулярных механизмов воспалительных реакций.

Целью настоящего исследования являлось изучение аденозин-опосредованной модификации цитокинового профиля моноцитов.

Материалы и методы

Исследования проводили на базе НОЦ «Клиническая и экспериментальная иммуногенетика» центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России. Материалом для исследования служила венозная кровь 30 здоровых доноров. Средний возраст участников исследования составил 25,1±1,3 года. Все доноры были осведомлены о целях исследования и подписали информированное согласие на участие в эксперименте. Забор крови осуществляли натощак из локтевой вены в количестве 30 мл в вакуумные пробирки с гепаринатом натрия. Выделение моноцитов осуществляли с помощью градиентного центрифугирования. На градиенте фиколла (ρ=1,077 г/см3, НПП «ПанЭко», Россия) получали фракцию мононуклеарных клеток, затем, используя двойной градиент перколла (ρ=1,130 г/мл, pH 8,5–9,5, «Sigma»,USA) и методом адгезии получали моноциты. Культивирование моноцитов осуществляли с добавлением IL-4 и GM-CSF («ProSpec», USA) в рабочей концентрации 20 нг/мл. В качестве стимулятора аденозиновых рецепторов использовали аналог аденозина 5'-N-этилкарбоксамидоаденозин (NECA) в концентрации 30 мкМ, контролем служил растворитель NECA диметилсульфоксид (DMSO).

По окончании времени культивирования проводили выделение общей РНК из моноцитов с использованием набора «QiagenRNeasyMinikit» («Qiagen», USA), согласно инструкции производителя. Синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили с использованием набора реактивов «Promega» (USA) на ДНК-амплификаторе («AppliedBiosystems», USA), согласно инструкции производителя. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили на детектирующем термоциклере ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия). Подбор праймеров производили с использованием программы IDT'sPrimerQuest, находящейся в свободном доступе в сети интернет (http://idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/). Для амплификации ДНК использовали следующие праймеры: IL-1β, прямой праймер: 5'-ATCTGTACCTGTCCTGCGTGTT-3', обратный:5'-TCTGCTTGAGAGGTG CTGATGT-3'; IL-6, прямой праймер: 5'-TGAAAGCAGCAAAGAG GCACTG-3', обратный: 5'-TTTCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3'; IL-8, прямой праймер: 5'-TCAGAGACAGCAGAGCACACAA-3', обратный: 5'-GGCCAGCTTGGAAGTCATGTTT-3'; IL-10, прямой праймер: 5'-TGCCTTCAGCAGAGTGAAGACT-3', обратный: 5'-TCTGGGTCTTGGTTCTCAGCTT-3'; IP-10, прямой праймер: 5'-CTGCCATTCTGATTTGCTGCCT-3', обратный: 5'-TGATGCAGGTACAGCGTACAGT-3'; βFGF, прямой праймер: 5'-atggtccctctaactgggcttt-3', обратный: 5'- AAGTGGTAGAGGAAGGCAGCTT-3'; VEGF, прямой праймер: 5'-GGGCAGAATCATCACGAAGTG-3', обратный: 5'-ATTGGATGGCAGTAGCTGCG-3' β-актин, прямой праймер: 5'-CGCCCCAGGCACCAGGGC-3', обратный: 5'-GGCTGGGGTGTTGAAGGT-3'. Уровень экспрессии мРНК цитокинов выражали по отношению к экспрессии мРНК β-актина. Для обработки данных по экспрессии генов использовали ΔΔCt-метод.

Определение базального и стимулированного NECA уровней секреции цитокинов IP-10, βFGF, TGF β, VEGF, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 в кондиционной среде культур моноцитов проводили методом неконкурентного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем «R&D Systems» (USA), согласно инструкции производителя.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prizm5. Нормальность распределения количественных показателей проверяли с помощью критерия Шапиро — Уилка. В случае нормального распределения для проверки достоверности различий количественных показателей в сравниваемых группах использовали t-критерий Стьюдента; в случае несоответствия нормальному закону — критерий Манна — Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне р<0,05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление