Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2014, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2014

Изучение иммуногенных свойств термостабильного и термолабильного летальных токсинов Yersinia pseudotuberculosis и их влияния на цитокиновые параметры крови в динамике развития иммунного ответа

А.В. Цыбульский, Н.Ф. Тимченко, Э.Я. Костецкий

Целью исследования является изучение иммуногенных и цитокин-модулирующих свойств выделенных методами хроматографии белковых токсинов Y. pseudotuberculosis – термостабильного (ТСТ) и термолабильного (TЛT). Эксперименты проводили на мышах линии СВА. Препараты токсинов вводили парентерально (п/к и в/бр). Антитела против ТСТ и ТЛТ, а также цитокины определяли методами иммуноферментного анализа. Белковый состав сыворотки крови определяли методом капиллярного зонного электрофореза. Установлено, что ТСТ при однократном в/м введении мышам в дозе 0,1 мкг/мышь проявляет слабо выраженную иммуногенность. Прирост содержания антител к ТСТ регистрировался в сроки 7–14 дней после иммунизации. ТЛТ при однократном в/м введении мышам в дозе 0,01 мкг/мышь не проявлял иммуногенности в отношении эффекторов специфического гуморального иммунного ответа. Иммунизация мышей ТСТ и ТЛТ в изученных дозах приводила к различным реакциям со стороны цитокиновых сетей регуляции. ТСТ вызывал преимущественно супрессию интерферонового звена и цитокинов провоспалительной направленности. ТЛТ активировал систему цитокинов провоспалительной направленности, что может вести к развитию иммунного ответа преимущественно по клеточному типу. Не выявлено изменений цитокиновых параметров, которые могли бы объяснить отсутствие специфического гуморального иммунного ответа при иммунизации животных ТЛТ. Сделан вывод о необходимости поиска оптимальных схем и маршрутов иммунизации белковыми токсинами Y. pseudotuberculosis, а также – подбора эффективного адъювантного сопровождения для достижения качественного по срокам развития и интенсивности иммунного ответа на эти антигены. (Цитокины и воспаление. 2014. Т. 13. № 2. С. 64–70.)

Ключевые слова: белковые токсины, Yersinia pseudotuberculosis, иммуногенность, цитокины.

В настоящее время бактериальные инфекции остаются глобальной проблемой. Стало очевидным, что остановить процесс распространения бактериальных инфекций среди населения и существенно повлиять на заболеваемость к настоящему времени не удалось. Более того, имеет место появление новых и возвращение старых инфекций. Ярким примером существования таких проблем являются возбудители чумы и псевдотуберкулеза (Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis). Это заставляет исследователей искать причины появления такой высокой агрессивности у возбудителей.

С середины ХХ столетия на Дальнем Востоке России начали регистрироваться периодические вспышки ранее неизвестного заболевания, названного до выяснения его этиологии дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой (ДСЛ). Было обнаружено, что возбудителем этого заболевания, протекающего с тяжелой клинической картиной и рецидивами, является Y. pseudotuberculosis [8]. Наблюдения позволили сформулировать положение, что ДСЛ является острой инфекционной болезнью, характеризующейся циклическим течением, интоксикацией, лихорадкой, экзантемой и преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, печени и суставов.

Возбудитель ДСЛ продуцирует факторы патогенности с инвазивной, антифагоцитарной и токсической функциями, кодируемыми хромосомными и плазмидными генами [1, 2, 4, 5, 8, 14]. В данной статье внимание сосредоточено на термостабильном и термолабильном токсинах (ТСТ и ТЛТ) – белках Y. pseudotuberculosis, вызывающих смерть экспериментальных животных (мышей), после парентерального их введения [5, 6, 8]. К настоящему времени установлено, что ТСТ вызывает выраженные полиорганные повреждения в организме с образованием типичных для псевдотуберкулеза гранулем с центральным кариорексисом, оказывает гепатотропное действие, которое проявляется в виде токсической дистрофии паренхиматозных клеток печени, формирования многочисленных некротических очагов, инфильтрированных полиморфноядерными лейкоцитами с примесью макрофагов. Электронно-микроскопическая картина свидетельствует о преобладающем повреждении мембранных ультраструктур паренхиматозных клеток органов [2, 9].

ТЛТ – иерсиниозный экзотоксин, по своим свойствам аналогичный цитотоксическому некротизирующему фактору Escherichia coli [14]. ТЛТ оказывает прямое повреждающее действие на эндотелий микрососудов и клетки паренхиматозных органов, вызывает тяжелые дистрофические и некротические изменения в органах, преимущественно в печени и почках, являющихся главными барьерами при поступлении токсина в организм [8, 9].

Изучение антигенных и иммуногенных свойств белковых токсинов Y. pseudotuberculosis как важных факторов патогенности представляет интерес с точки зрения возможности использования этих антигенов в качестве протективных при приготовлении на их основе вакцинных препаратов. Особый интерес представляет оценка подобной возможности в отношении ТЛТ. Этот белковый экзотоксин отличается существенно большей токсичностью в сравнении с ТСТ и другими бактериальными токсинами (LD50 ТЛТ для беспородных белых мышей составляет 0,4 мкг белка в сравнении с 4,5 мкг, характерными для ТСТ) [8]. Если экспрессия гена ТСТ практически конститутивна для Y. pseudotuberculosis и выявляется в абсолютном большинстве изученных штаммов [8], то появление в структуре бактериального генома и экспрессия гена ТЛТ всегда сочетается с резким увеличением вирулентности Y. pseudotuberculosis и приводит к более тяжелому клиническому течению заболевания [9, 11, 13]. На этом основании можно сделать предположение о перспективности изучения этих двух бактериальных экзотоксинов как потенциальных протективных антигенов с целью построения на их основе вакцинных препаратов. Это особенно актуально в свете известной информации о безуспешности попыток создания протективных вакцин против псевдотуберкулеза на основе стандартных вакцинных технологий с использованием инактивированных бактерий.

Целью настоящей работы является изучение некоторых биологических свойств TСT и TЛT Y. pseudotuberculosis: способности этих белков индуцировать синтез специфических антитоксических антител и влиять на цитокиновые параметры крови в динамике развития специфического иммунного ответа.

Материалы и методы

В работе использованы мыши линии СВА массой 18–20 г (самцы). Животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

Токсины выделяли методами, описанными в работах [5, 9]. ТСТ (белок с молекулярной массой 45 кДа) выделяли из штамма Y. pseudotuberculosis 512,1 серотипа, изолированного из фекалий больного на Дальнем Востоке России, а ТЛТ (белок с ММ 200 кДа) – из штамма 2517, 3 серотипа (полученного из института им. Л.Пастера, Франция).

Оценку иммуногенных свойств токсинов и их влияния на цитокиновые показатели проводили в динамике (в сроки через 1, 3, 7, 14 и 28 сут после иммунизации) путем исследования сыворотки крови иммунизированных мышей. Применяли однократную схему иммунизации TСT в дозе 0,1 мкг/мышь и TЛT в дозе 0,01 мкг на мышь. Препараты вводили внутримышечно (в/м) в объеме 10 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (pH 7,2). Дозы токсинов были выбраны на основании ранее проведенных экспериментов, показавших протективный эффект в условиях модельной летальной инфекции мышей, инфицированных Y. pseudotuberculosis.

Антитела против токсинов в сыворотках крови определяли твердофазным неконкурентным иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием антивидовых антимышиных IgG козы, меченых пероксидазой. Сенсибилизацию твердой фазы проводили соответственно раствором TСT и TЛT в концентрации 5 мкг/мл [10]. В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин (BD, США). Уровень специфических антител определяли с использованием планшетного спектрофотометра Elx808-iu (BioTek, США) при длине волны 450 нм.

Определение цитокинов проводили с помощью ИФА с использованием наборов BD ELISA Set Mouse для интерлейкинов IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, а также для интерферона гамма (IFNγ), фактора некроза опухоли (TNF), трансформирующего фактора роста (TGFβ1) и гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (GM-CSF) в соответствии с указаниями в приложенных к наборам инструкциях. Определяли относительное содержание цитокинов в каждой экспериментальной группе, выраженное в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм.

Анализ белков сывороток крови мышей, иммунизированных токсинами, осуществляли методом капиллярного зонного электрофореза с использованием аппарата капиллярного электрофореза Agilent CE в соответствии с методическими указаниями [3] в нашей модификации. В качестве рабочего буфера использовали 10 мМ натрий тетраборнокислый (pH 9,3). Сыворотки крови мышей разбавляли дистиллированной водой в 25 раз. Использовали капилляр Lэфф/Lобщ=64/72 см, ID=72 мкм. Ввод пробы осуществляли при 150 мбар × с. Электрофорез проводили при напряжении +30 кВ и температуре 22 °С. Детектирование проводили при длине волны195 нм. Показатели содержания глобулиновой фракции сывороток крови оценивали по площади электрофоретического пика и выражали графически.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием прикладной программы SPSS 11.0 с определением критерия достоверности Фишера–Стьюдента. Различия между средними считали достоверными при p<0.05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление