Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2014, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2014

Определение типа иммунного ответа на отдельные эпитопы искусственного модельного белка TBI – компоненты вакцины «КомбиВИЧвак».

Мальцев С. В., Рыжиков Е.А., Рыжиков А. Б.

Цель настоящей работы - исследование антигенных свойств каждого из эпитопов белка TBI – компоненты вакцины «КомбиВИЧвак», а так же установление типа иммунного ответа на отдельные эпитопы этого белка. В ходе работ было синтезировано 9 пептидно-белковых конъюгатов на основе панели пептидов, мимикрирующих эпитопы белка TBI. Этими синтетическими конструкциями иммунизировали мышей ICR с целью получения цельной крови для последующей её стимуляции пептидными антигенами. По истечении инкубации из стимулированной крови выделяли сыворотки, которые анализировали в ИФА на наличие следующих цитокинов: ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10, ФНОα, ИНФγ и ИЛ-1β. Результаты ИФА на цитокины подтвердили наличие гуморального иммунного ответа на все эпитопы белка TBI. Также было установлено, что отдельные пептиды не способны формировать значительный иммунный ответ в отличие от синтетических иммуногенных конструкций на основе этих пептидов. Была установлена устойчивая коррелиция между титром IgG и индексами влияния цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНОα для иммунодоминантного эпитопа. Методология поэпитопного определения типа и степени иммунного ответа, сформулированная в данной работе, может быть применена для изучения картины иммунного ответа на любой другой белок. (Цитокины и воспаление. 2014. Т. 13. № 2. С. 75–81.)

Ключевые слова: TBI, цитокин, пептид, эпитоп, конъюгат.

Введение

По данным Всемирной организиции здравоохранения Россия занимает 1 место в мире по ежегодному приросту числа ВИЧ-инфицированных. Согласно данным Федерального центра по профилактике и борьбе со СПИДом число ВИЧ-инфицированных в России уже превышает полмиллиона человек и продолжает расти в среднем на 50 тысяч в год. В связи с этим задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение в нашей стране.

Одной из перспективных разработок отечественных исследователей является вакцина против ВИЧ-инфекции «КомбиВИЧвак». В настоящее время эта вакцина проходит первую фазу клинических исследований. Вакцина состоит из двух функциональных элементов: полиэпитопный искусственный белок TBI и плазмида pcDNA-TCI.

Белок TBI (T- and В-cell epitopes containing immunogen) был сконструирован в виде полипептида с заранее предполагаемой антигенной и пространственной структурой [1, 2]. В основу пространственной структуры был положен предполагаемый пространственный мотив – четырехспиральный пучок. Антигенная же структура белка TBI включает пять В-клеточных ВИЧ-нейтрализующих эпитопов из белков, кодируемых генами env и gag ВИЧ-1, и четыре эпитопа хелперных Т-лимфоцитов. Ранее был найден иммунодоминантный эпитоп белка TBI посредством пептидного картирования, а так же частично раскрыт механизм его иммунодоминантности [3]. Было показано, что у мышей и обезьян, иммунизированных рекомбинантным белком TBI, формируются специфические антитела, обладающие вируснейтрализующей активностью [4].

Несмотря на то, что вакцинной конструкции «КомбиВИЧвак» было посвящено несколько исследовательских работ [5, 6], детального исследования структурно-функциональной организации белка TBI не было проведено.

Целью настоящей работы является исследование антигенных свойств каждого из эпитопов белка TBI, а так же установление типа иммунного ответа на отдельные эпитопы этого белка.

Материалы и методы

Ex vivo антигенная стимуляция клеток крови иммунных мышей

Пробы крови брали из ретроорбитального синуса иммунных мышей и разбавляли 1:4 в питательной среде с гепарином для разведения цельной крови. Кровь делили на 3 части для спонтанной стимуляции, для стимуляции митогеном и для стимуляции антигеном.

При спонтанной стимуляции кровь смешивали со средой 1:7 соответственно. При стимуляции митогеном кровь смешивали с раствором митогена (конконавалина А, 50 мкг/мл) в среде 1:7. При антигенной стимуляции кровь смешивали с раствором антигена 1:7, итоговая концентрация антигена в смеси с кровью – 30 мкг/мл.

Полученные пробы инкубировали в течение 18-20 часов при 37 град С. После окончания инкубации пробы центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость замораживали при – 20 град С до проведения анализа ИФА цитокинов.

Определение титра IgG методом ИФА

На 96-луночный планшет для иммунологических реакций сорбировали антиген в КББ с концентрацией 1 мкг/мл по 150 мкл в лунке в течение 12-18 часов при комнатной температуре.

В планшет с сорбированным антигеном по 100 мкл в лунку вносили растворы проб сывороток в РРС (ЗАО «Эпитек»), анализируемых на наличие в них антител к сорбированному антигену. Разведение сывороток в РРС зависит от условий эксперимента. Планшет инкубировали в термошейкере для планшет в течение 1 ч при 37 С и 700 rpm.

Промывали планшет раствором ФСБ-Т (ЗАО «Эпитек») и заполняли по 100 мкл в лунку раствором соответствующего антивидового коньюгата (в РРС), ковалентно связанного с пероксидазой хрена. Планшет с конъюгатом инкубировали в термошейкере для планшет 30 минут при 37 С и 700 rpm.

После промывки от конъюгата планшет заполняли по 100 мкл в лунке смесью растворов ТМБ и БРС 1:30 и выдерживали 20 минут в темноте при комнатной температуре, после чего добавляли по 50 мкл стоп-реагента в лунку и измеряли поглощение на фотометре при длине волны 450 нм.

Определение концентрации цитокинов в ex vivo антиген-стимулированной цельной крови

Для изучения типа иммунной реакции (Th1 или Th2) на эпитопы белка TBI применили метод ex vivo стимуляции клеток цельной крови. Для количественной оценки реакции иммунной системы на антиген использовали индекс влияния (ИВ) - отношение индуцированной продукции цитокинов к спонтанной, ИВм – индекс влияния митогена, ИВаг – индекс влияния антигена. Достоверной считали стимуляцию, при которой ИВ больше 2. Другим количественным параметром напряженности клеточного иммунитета служит цитокиновый индекс ЦИ [7] – отношение антиген-индуцированной продукции к митоген-стимулированной продукции.

Для определения концентрации цитокинов в супернатантах клеток крови использовали наборы ИФА для выявления цитокинов мыши (ЗАО «Эпитек»). Концентрацию цитокинов в пробе измеряли в пкг/мл с использованием калибровочных растворов с известными концентрациями цитокинов [8]. Супернатанты клеток крови мыши анализировали на наличие следующих цитокинов: ИНФγ, ФНОα, ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10. Анализируемую кровь предварительно стимулировали двумя типами антигенов – низкомолекулярными пептидными и высокомолекулярными конъюгатами пептидов с БСА.

В качестве параметра, характеризующего степень синтеза определённого цитокина, принимали цитокиновый индекс. Индекс считали равным нулю, если индекс влияния не превышал значения 2.

Конъюгирование пептидов с белком-носителем

Для конъюгирования пептидов, несущих отдельные эпитопы белка TBI, использовали два белка-носителя: БСА и KLH. Конъюгацию пептидов осуществляли через сульфогидридные группы пептидов и аминогруппы белка-носителя. Для обеспечения стандартных условий конъюгирования каждый из 9-ти пептидов содержал цистеин на С-или N-конце и не содержал цистеин во внутренней части.

Белок-носитель растворяли в 0,6 М ФСБ до концентрации 10 мг/мл и смешивали с 10 mM раствором активатора (Pierce Products) аминогруппы белка-носителя sulfo-SMCC (5 мг/мл) в дистиллированной воде. Активатор смешивали с белком в соотношении 1:2 (для KLH) или 3:4 (для БСА) по массе соответственно. Смесь инкубировали 1 час при комнатной температуре. После инкубации избыток sulfo-SMCC удаляли на уравновешенной 0,6 М ФСБ обессоливающей колонке центрифугированием при 1000g.

Пептид, содержащий сульфогидридную группу, растворяли в 0,6 М ФСБ до концентрации 4 мг/мл. Раствор смешивали с активированным белком-носителем в соотношении 1:1 по массе и смесь инкубировали 2 часа при комнатной температуре. Продукт реакции диализовали против ФСБ, разделяли на аликвоты и хранили при -20оС до использования при иммунизации животных или в реакции ИФА.

Степень конъюгирования оценивали по уменьшению оптической плотности в ИФА, используя сыворотку к белку-носителю, а также по динамике изменения поглощения при 280 нм.

Иммунизация мышей белком TBI и его фрагментами

Аутбредным мышам ICR вводили 20 мкг белка TBI или синтезированных конъюгатов антигенных пептидов с KLH подкожно в 0,2 мл суспензии с гидроксидом алюминия 4 раза с интервалом 14 дней. Через 10 дней после последней иммунизации у мышей брали пробы крови из ретроорбитального синуса для последующей обработки [9].

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление