Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2014, № 3

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 3'2014

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА АКТИВНОГО ЦЕНТРА GM-CSF ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАДИАЦИОННО ИНДУЦИРОВАННОЙ МИЕЛОСУПРЕССИИ

А.В. Аклеев, Г.А. Тряпицына, А.С. Симбирцев, А.А. Аклеев, Е.А. Пряхин, А.В. Зурочка

Оценено влияние синтетического пептида активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) на гемопоэз у мышей в условиях нормального физиологического состояния животных и в период постлучевого восстановления гемопоэза. Показано, что синтетический пептид активного центра GM-CSF обладает селективным стимулирующим эффектом у животных с лучевым угнетением гемопоэза. Однократное введение препарата в дозе 0,005 мкг/г самкам мышей C57Bl/6, подвергшихся фракционированному облучению в дозе 10 Гр, у которых развивалось угнетение костномозгового кроветворения и цитопения, оказывало стимулирующий эффект на гранулоцитарный и моноцитарный ростки кроветворения. Введение пептида активного центра GM-CSF облученным животным не влияло на содержание КОЕс в костном мозге (КМ), но оказывало стимулирующее действие на популяцию этих клеток у интактных животных. Не отмечено влияния препарата на развитие экстрамедуллярного кроветворения в селезенке облученных мышей. Пептид активного центра GM-CSF может быть рекомендован для лечения радиационно-индуцированной миелосупрессии у людей. (Цитокины и воспаление. 2014. Т. 13. № 3. С.22–30.)

Ключевые слова: нейтропения, синтетический активный пептидный центр колониестимулирующего фактора, периферическая кровь, костный мозг, гамма-излучение, мыши.

Известно, что стволовые кроветворные клетки (СКК) и клетки-предшественники, обладающие наибольшей радиочувствительностью, являются основной мишенью при радиационном воздействии. Радиационное повреждение их вызывает компенсаторное повышение скорости репарации сублетальных повреждений, пролиферативной активности сохранившихся жизнеспособных клеток, ускорение прохождения клеточного цикла костномозговыми предшественниками и другие механизмы, приводящие к стимуляции гемопоэза. В случае недостаточности вышеуказанных компенсаторных механизмов снижается функциональный резерв и жизнеспособность зрелых клеток крови, что является показателем неэффективности гемопоэза и клинически проявляется в виде цитопении (наиболее часто гранулоцитопении). Цитопения нередко сопровождается изменениями иммунитета. Пострадиационное восстановление гемопоэза характеризуется постепенным восстановлением клеточного состава костного мозга, периферической крови и нормализацией показателей иммунитета, но даже в отдаленные сроки у облученных лиц может сохраняться гранулоцитопения [1, 12]. Данные, полученные в экспериментах на животных, подвергшихся облучению в низких дозах, свидетельствуют о том, что замедленное восстановление клеточного состава костного мозга и периферической крови обусловлено некоторым дефицитом СКК и гемопоэтических предшественников [10].

В рамках настоящей работы в экспериментальной модели предпринята попытка коррекции гранулоцитопении посредством стимуляции кроветворных клеток-предшественников синтетическим пептидом активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF – granulocyte-macrophage colony-stimulating factor). Применение пептида активного центра GM-CSF позволяет не только понять механизмы отдаленных цитопений у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, но и обосновать применение препарата в клинической практике. Известно, что GM-CSF стимулирует пролиферацию и созревание не только клеток-предшественников и дифференцированных гранулоцитов костного мозга, но и повышает функциональную активность зрелых гранулоцитов крови [10]. До настоящего времени GM-CSF, как и G-CSF, и пегилированный G-CSF остаются единственными официально разрешенными Агентством по контролю за качеством продуктов и лекарств США (US FDA) препаратами для коррекции радиационно-индуцированной миелосупрессии и потенциально летального угнетения гранулоцитопоэза после лучевой терапии. Необходимо отметить, что гемопоэтические факторы роста уже применялись в случаях аварийного облучения. Например, при облучении в Гайане (Бразилия) использование GM-CSF оказывало некоторый положительный эффект, но не спасало больных от смерти, вероятно, из-за позднего применения препарата [13]. В последние годы показано, что синтетические пептиды активного центра GM-CSF могут обладать не только колониестимулирующей активностью, как цельная молекула фактора, но и иммуностимулирующими, антибактериальными и репарационными свойствами [4, 5, 6, 7]. Принимая во внимание вышесказанное, целью исследования было оценить влияние синтетического пептида активного центра GM-CSF на восстановление лейкопоэза после лучевого повреждения.

Материалы и методы

Влияние пептидного активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора GM-CSF на гемопоэз у мышей оценивали как на фоне нормального физиологического состояния животных, так и в период постлучевого восстановления гемопоэза. В качестве биологического объекта в исследовании использовали самок мышей линии C57Bl/6. Животных содержали на полноценном рационе, воду не ограничивали. Всего использовано 650 животных. В проведенных ранее экспериментах было показано, что при хроническом воздействии γ-излучения на мышей с мощностью 4 сГр/сут лейкопения развивалась при суммарной поглощенной дозе 7 Гр, а выраженная цитопения при суммарной поглощенной дозе 10 Гр и выше [11]. С учетом этого, для индукции цитопении самок мышей C57Bl/6 подвергали фракционированному облучению (в течение 5-ти недель с интервалом между фракциями 7 дней, доза на фракцию составляла 2 Гр) в суммарной дозе 10 Гр. Облучение животных проводили на установке ИГУР-1. Мощность дозы γ-излучения установки составляла 0,7 Гр/мин, неравномерность γ-поля в рабочем пространстве составляла не более 5 %.

В качестве стимулятора гемопоэза использовали синтетический пептид активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (химическая формула - THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), произведенный в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов ФМБА России. Синтез пептида проводили твердофазным способом на синтезаторе «Applied Biosystems 430A» (США) методом in situ c использованием Nα-Boc-защищенных производных аминокислот.Для блокирования боковых цепей трифункциональных аминокислотных остатков использованы защитные группы бензильного и уретанового типов.Присоединение аминокислотных остатков проводили методом 1-гидроксибензотриазоловых эфиров, используя 5-кратные избытки реагентов. По завершении сборки полипептидной цепи пептидил-полимер обрабатывали жидким фтористым водородом по Sn1/Sn2 механизмам в присутствии скавенджеров.Продукт высаживали диэтиловым эфиром и очищали методом препаративной обращенно-фазовой хроматографии до гомогенного состояния.Конечные продукты охарактеризованы данными аминокислотного и масс-спектрального анализов.Аминокислотный состав полученных соединений и их молекулярный вес соответствовали теоретическим, чистота по данным аналитической обращенно-фазовой высоко эффективной жидкостной хроматографии была не менее 95 %.

Препарат вводили животным в дозе 0,005 мкг/г. С целью приготовления препарата для введения использовали лекарственную форму лиофилизат, который представляет собой водорастворимый негликозилированный белок. Содержимое флакона (2 мг) растворяли в 20 мл физиологического раствора (раствор № 1). Затем готовили раствор для введения (раствор № 2) в соотношении 1 мл физиологического раствора : 1 мкл раствора № 1 препарата. Животным однократно внутрибрюшинно вводили раствор № 2. Животным контрольных групп вводили физиологический раствор в том же объеме.

Для оценки влияния пептида активного центра GM-CSF на состояние гемопоэза у экспериментальных животных было сформировано четыре экспериментальные группы:

1) группа биологического контроля;

2) группа интактных животных, которым вводили пептид активного центра GM-CSF;

3) группа животных, подвергшихся фракционированному облучению в суммарной дозе 10 Гр;

4) группа животных, подвергшихся фракционированному облучению в суммарной дозе 10 Гр, которым вводили пептид активного центра GM-CSF.

Через два месяца после завершающей фракции облучения животным 2-й и 4-й групп внутрибрюшинно вводили пептид активного центра GM-CSF. Состояние гемопоэза оценивали по количеству КОЕс в костном мозге (экзотест), клеточному составу костного мозга (КМ) и периферической крови, количеству ядросодержащих клеток в селезенке (спленоцитов). Получение клеточных суспензий селезенки, костного мозга и подсчет клеток в них выполнен в соответствии с методиками, описанными в работе [11]. Процедуру метода экзотеста проводили в точном соответствии с модификацией, предложенной А. Е. Переверзевым [8]. Исследование гемопоэза проводили в течение девяти месяцев. Первое исследование состояния гемопоэза проводили перед облучением, второе – на следующие сутки после завершающей фракции облучения. Последующие исследования выполняли через 1, 2 (перед введением пептида активного центра GM-CSF), 3, 5 и 8 месяцев после завершения облучения (последние три обследования соответствуют 1, 3 и 6 месяцам после введения пептида животным 2-й и 4-й групп).

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление