Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер
3 номер 4 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2014, № 4

Подписаться на 2018 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

События года

Номер 4'2014

Нобелевская премия по химии 2014 года: микроскопия сверхвысокого разрешения преодолевает дифракционный барьер

Шведская Королевская Академия наук в 2014 г. присудила Нобелевскую премию в номинации «Химия» Эрику Бетцигу (Eric Betzig, Медицинский институт Говарда Хьюза, США), Штефану Хеллю (Stefan W. Hell, Институт биофизической химии Общества Макса Планка, Германия) и Уильяму Мернеру (William E. Moerner, Стенфордский университет, США) за разработку флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения.

Микроскопия является основным методом исследования для таких медико-биологических дисциплин как гистология, цитология, клеточная биология, нейробиология и патологическая анатомия. В качестве важного вспомогательного метода микроскопию живых и фиксированных объектов используют при решении своих задач все отрасли биологии и медицины, почетное место среди которых занимает иммунология.

Микроскопия в свое время помогла обосновать многие ключевые концепции биологии и проникнуть в тайны строения клеток и тканей. В настоящее время современные биологические микроскопы — сложные высокотехнологичные приборы, позволяющие проводить морфологические исследования и диагностику с одновременной документацией получаемых фотоизображений микропрепаратов.

Однако у общеизвестной световой микроскопии существует предел разрешающей способности (дифракционный барьер), который не позволяет детально изучать микроскопические объекты, имеющие размеры менее 200–250 нм. К таким объектам относится большинство органелл цитоплазмы клеток человека и животных. Вследствие дифракции света увеличенное изображение объекта оказывается размытым (несколько отдельных, но расположенных близко друг к другу структур объекта воспринимаются глазом как одна). Еще в XIX в. Э. Аббе (E. Abbe) и Дж. Рэлэй (J.W. Rayleigh) сформулировали принцип, в соответствии с которым предельное разрешение микроскопа не может быть больше половины длины волны освещающего объект света. Исходя из этого принципа, предел разрешения объектива микроскопа вычисляется следующим образом:

lmin=0,61λ/n·sinα,

где λ — длина волны света, n — показатель преломления иммерсионной среды, α — аппертурный угол (максимальный угол, который образуют лучи, попадающие в объектив, с оптической осью системы).

Выражение NА=n·sinα называют числовой аппертурой. Значение показателя NA указано на оправе каждого объектива современного светового микроскопа. Для объективов обычных исследовательских микроскопов показатель NA не превышает 1,25–1,3 (объективы, использующие масляную иммерсию). У такого микроскопа пределом разрешения при использовании зеленого светофильтра (пропускающего свет длиной волны около 500 нм) будет 234 нм.

Для того чтобы преодолеть предел разрешения светового микроскопа в 30-е гг. XX в. были разработаны основы электронной микроскопии [1]. Однако сразу создать технологический комплекс для ультраструктурного исследования биологических объектов не удалось. Лишь в 60-х гг. XX в. электронная микроскопия наряду с традиционной световой микроскопией заняла достойное место в арсенале микроскопических методов. Несмотря на очевидные достоинства, метод электронной микроскопии имеет и существенные недостатки. Так, по сравнению с техникой подготовки материала для световой микроскопии, пробоподготовка для электронной микроскопии чрезвычайно сложна [2]. Но самым главным ограничением для широкого применения электронного микроскопа в клеточной биологии является отсутствие возможности для исследования живых объектов.

Необходимость морфологической верификации новых открытий, выполненных с использованием методов генетики, биохимии и иммунологии привела к поиску новых способов преодоления дифракционного барьера и увеличения разрешающей способности микроскопов. Одним из современных приборов, который позволяет увеличить разрешающую способность оптической системы в 1,4 раза является конфокальный лазерный сканирующий микроскоп [3]. Активное использование конфокальной лазерной микроскопии в медико-биологических исследованиях началось в конце ХХ в. (спустя почти 40 лет после разработки теоретических основ конфокальной микроскопии). Этот метод незаменим при необходимости изучения пространственной организации микроскопических объектов [4]. В дальнейшем метод был усовершенствован для увеличения аксиального разрешения микроскопа и появилась 4Pi-микроскопия [5]. Параллельно с этим разрабатывались методы микроскопии с использованием структурированного освещения (SIM) и флуоресцентная микроскопия в стоячих волнах (SWFM).

В настоящее время наиболее востребованными и перспективными среди методов увеличения разрешающей способности микроскопа являются два принципиально различных подхода, использующих разные физико-химические особенности флуоресцирующих веществ, применяемых для визуализации микроскопических объектов. Они позволяют добиться разрешения в 20 нм (и это не предел), что приблизительно в 10 раз выше, чем в обычном световом микроскопе (сопоставимо с разрешением электронного микроскопа). Это — метод последовательной фотоактивации молекул флуорохрома (PALM) и метод истощения стимулированной эмиссии (STED). Именно за разработку этих двух методов в 2014 г. Эрику Бетцигу, Штефану Хеллю и Уильяму Мернеру была присуждена Нобелевская премия по химии. Их основополагающие теоретические работы относятся к последнему десятилетию прошлого века [6–10], однако уже сейчас доступно несколько моделей микроскопов, в которых применяются принципы, разработанные нынешними нобелевскими лауреатами.

Основными достоинствами STED- и PALM-микроскопии является отсутствие теоретических пределов для увеличения разрешающей способности микроскопической техники и принципиальная возможность их использования при изучении живых объектов.

Методы, разработанные Э. Бетцигом, Шт. Хеллем и У. Мернером, продолжают совершенствоваться. Характерно, что технологический прогресс позволил быстро воплотить многообещающие идеи исследователей в конкретные приборы. Можно надеяться, что широкое использование микроскопии сверхвысокого разрешения откроет новые перспективы для развития клеточной биологии и позволит сделать много открытий в различных областях биологии и медицины.

Литература

  1. Ruska E. Uber fortschritte im bau und in derleistung des magnetischen elektronenmikroskops // Zeitschrift fur Physik. 1934. Bd. 87. S. 580–602.

  2. Коржевский Д.Э., Гилерович Е.Г., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Григорьев И.П. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии: руководство (под ред. Д.Э. Коржевского). СПб.: СпецЛит, 2013. 127 с.

  3. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Колос Е.А., Карпенко М.Н., Суфиева Д.А., Назаренкова А.В. Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной и лазерной микроскопии: руководство (под ред. Д.Э. Коржевского). СПб.: СпецЛит, 2014. 111 с.

  4. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Гиляров А.В., Соловьев К.В., Грудинина Н.А. Изучение пространственной организации астроцитов головного мозга при помощи конфокальной лазерной микроскопии // Морфология. 2009. Т. 135. № 3. С. 76–79.

  5. Hell S.W., Stelzer E.H.K., Lindek S., Cremer C. Confocal microscopy with an increased detection aperture: Type-B 4Pi confocal microscopy // Opt. Lett. 1994. Vol. 19. P. 222–224.

  6. Betzig E. Proposed method for molecular optical imaging // Opt. Lett. 1995. Vol. 20. P. 237–239.

  7. Betzig E., Patterson G.H., Sougrat R., Lindwasser O.W., Olenych S., Bonifacino J.S., Davidson M.W., Lippincott-Schwartz J., Hess H.F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution // Science. 2006. Vol. 313. P. 1642–1645.

  8. Dickson R.M., Cubitt A.B., Tsien R.Y., Moerner W.E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein // Nature. 1997. Vol. 388. P. 355–358.

  9. Hell S.W., Wichmann J.Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy // Opt. Lett. 1994. Vol. 19. P. 780–782.

  10. Hell S.W., Kroug M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: a concept for breaking the diffraction resolution limit // Appl. Phys. B. 1995. Vol. 60. P. 495–497.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление