Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер
3 номер 4 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2014, № 4

Подписаться на 2018 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 4'2014

Экспрессия проапоптотического белка у больных пузырчаткой

А.А. Кубанов, О.Р. Катунина, Т.В. Абрамова

Структурный белок десмосом PERP участвует в межклеточной адгезии и обеспечении процессов апоптоза. Согласно новой гипотезе, в развитии акантолиза при пузырчатке могут быть задействованы апоптотические сигнальные пути. Цель исследования: изучение экспрессии проапоптотического белка PERP у больных пузырчаткой. Материалы и методы: с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа определяли экспрессию структурного белка десмосом PERP методом непрямой иммунофлуоресценции в биоптатах кожи 30 больных пузырчаткой и 10 здоровых лиц. Результаты. Впервые установлена экспрессия структурного белка десмосом PERP на поверхности кератиноцитов. У больных пузырчаткой количественные показатели экспрессии белка PERP в очагах поражения (439,71±31,85) и в клинически непораженной коже (484,81±37,10) статистически не отличались (р0,05). Уровень содержания белка PERP был достоверно выше в коже здоровых лиц (624,60±35,24), чем у больных пузырчаткой (р≤0,05). Установлена обратная корреляционная связь между количественными показателями экспрессии PERP у больных пузырчаткой в участке видимо здоровой кожи и длительностью заболевания (r=-0,5; p0,03). Таким образом, развитие симптомов пузырчатки (клинических — формирование пузырей на коже и/или слизистых оболочках, гистологических — акантолиза) отмечается на фоне снижения экспрессии структурного белка десмосом PERP. (Цитокины и воспаление. 2014. Т. 13. № 4. С. 23–28)

Ключевые слова: пузырчатка, PERP, апоптоз, акантолиз, реакция непрямой иммунофлуоресценции.

Пузырчатка — буллезное заболевание кожи и слизистых оболочек, патогенетическая роль в развитии которого принадлежит аутоиммунным реакциям, приводящим к акантолизу. Пузырчатка развивается преимущественно в трудоспособном возрасте и отличается тяжелым течением [9].

Патогенетическую роль в формировании пузырей при пузырчатке играют аутоантитела к структурным компонентам десмосом. Основными компонентами десмосом являются Ca2+-связывающие белки клеточной адгезии, относящиеся к семейству кадгеринов (десмоглеины 1–4 (Dsg1–4) и десмоколлины 1–3 (Dscs1–3)), а также соединительные (адапторные) белки (десмоплакин, плакофиллин и плакоглобин). Дефекты в любом из компонентов десмосом могут приводить к нарушению межклеточной адгезии и к образованию пузырей [11].

В 2000 г. Attardi L.D. и др. в составе десмосом открыли белок PERP («p53 apoptosis effector related to PMP-22» — апоптотический эффектор белка р53, родственный миелиновому белку-22) [6]. Позднее Bektas M., Jheon A.H. и др. показали, что белок PERP необходим для реализации функций десмосом по обеспечению межклеточной адгезии в коже и слизистых оболочках, регуляции пролиферации кератиноцитов, а также для реализации процессов апоптоза [7, 10].

Механизмы акантолиза при пузырчатке до настоящего времени точно не установлены. Существует несколько гипотез развития этого процесса.

Согласно десмоглеиновой гипотезе, аутоантитела против десмоглеинов 3 и 1 блокируют их адгезивную функцию, что приводит к потере связи между кератиноцитами и влечет за собой развитие акантолиза [1].

В 1999 г. была предложена компенсационная гипотеза развития акантолиза, основанная на особенностях экспрессии десмоглеинов. Известно, что Dsg1 экспрессируется преимущественно в коже, в основном, в поверхностных слоях эпидермиса, а Dsg3 — в базальном и супрабазальном слоях эпителия слизистых оболочек и кожи. Согласно данной гипотезе, для обеспечения полноценного межклеточного взаимодействия достаточно одного из десмоглеинов — Dsg1 или Dsg3. При формировании аутоантител к Dsg1 формируются субкорнеальные пузыри в коже и одновременно в эпителии слизистых оболочек, вследствие разрушения Dsg1, наблюдается компенсаторное увеличение Dsg3. И, наоборот, при формировании аутоантител к Dsg3 на слизистых оболочках образуются супрабазальные пузыри, а разрушение Dsg3 компенсируется повышением экспрессии Dsg1. Поражение и кожи, и слизистых оболочек наблюдается при одновременном формировании аутоантител к Dsg1 и Dsg3 [4].

Однако компенсационная теория не может полностью объяснить появления внутириэпидермальных пузырей при пузырчатке, так как не учитывает сложных взаимодействий всех компонентов десмосом. Исключительно Dsg3 не может обеспечить прочность межклеточных контактов десмосом. Это подтверждается экспериментальными исследованиями Vu T.N., в которых было выявлено отсутствие спонтанного развития пузырей у Dsg3-нокаутных мышей. Это позволило предположить участие в формировании внутриэпидермальных пузырей не только Dsg3, но и других структурных компонентов десмосом, обеспечивающих связь между кератиноцитами [13]. К настоящему времени выявлено более 40 белков, с которыми связываются аутоантитела при пузырчатке. В последние годы проводятся исследования по изучению роли в развитии акантолиза при пузырчатке не только десмоглеинов, но и других молекул адгезии, белка PERP, различных рецепторов клеточных мембран, митохондриальных белков и других молекул, входящих в состав десмосом [9].

В 2004 г. Wang X. предположил, что ведущую роль в индукции акантолиза при пузырчатке может играть апоптоз кератиноцитов, вызванный нарушением их функционирования из-за потери контакта с соседними клетками или внеклеточным матриксом (так называемый анойкис) [14]. Появляются новые данные, подтверждающие участие апоптоза в формировании пузырей при пузырчатке, что позволило Grando S.A. и др. сформулировать новый термин «апоптолиз» [2, 9]. Согласно новой гипотезе, аутоантитела активируют сигнальные пути, вызывающие акантолиз и апоптоз. Пемфигусные аутоантитела связываются с антигенами на плазматической мембране кератиноцитов по типу связывания рецептора с лигандом, что приводит к активации рецепторов, сигнальных элементов и инициации молекулярных каскадов программированной гибели кератиноцитов. В результате нарушаются конформационные свойства (и возникают диссоциации) междесмосомных адгезионных комплексов, и, как следствие, происходит сепарация и последующий разрыв десмосом [9]. Одним из белков, обладающих проапоптотической функцией, является структурный белок десмосом PERP.

Изучению роли белка PERP в развитии пузырчатки посвящено лишь несколько зарубежных работ, которые проводились на экспериментальных моделях пузырчатки [12].

Nguyen B. и др. (2009) при проведении экспериментов на клеточной культуре кериатиноцитов человека и мышей обнаружили уменьшение экспрессии PERP на мембранах кератиноцитов под действием пемфигусных аутоантител. Иммуногистохимическим методом было установлено, что после нанесения иммуноглобулина IgG белки Dsg3 и PERP отделялись от цитоплазматической мембраны кератиноцитов и вместе со структурным белком десмосом плакоглобином погружались в цитоплазму, где подвергались разрушению в лизосомах. Авторы также показали, что при дефиците PERP усиливаются патогенные эффекты аутонтител на кератиноциты, с одной стороны — за счет уменьшения количества десмосом, с другой — за счет нарушения их связи с цитоскелетом кератиноцитов. Вышеизложенное позволило исследователям сделать вывод об участии некадгериновых белков десмосом в развитии фенотипа пузырчатки [12]. Это позволило сделать вывод о том, что белок PERP необходим для обеспечения адгезивной функции десмосом.

Таким образом, функции белка PERP многогранны: наряду с участием в реализации апоптоза он регулирует пролиферацию кератиноцитов и обеспечивает межклеточную адгезию.

Однако исследования по изучению экспрессии белка PERP у больных пузырчаткой до настоящего времени не проводились.

Цель исследования состояла в изучении экспрессии проапоптотического белка PERP у больных пузырчаткой.

Материалы и методы

В основную группу были включены 30 больных пузырчаткой, из них 17 (56,7 %) мужчин и 13 (43,3 %) женщин в возрасте от 18 до 76 лет (средний возраст — 54,22±17,6 года). Среди них вульгарная пузырчатка была диагностирована у 22 (73,3 %) больных, себорейная — у 8 (26,7 %). Диагноз пузырчатки устанавливали на основании данных клинической картины, результатов цитологического и гистологического исследований, реакции непрямой иммунофлуоресценции с антителами к IgG. Тяжесть течения пузырчатки оценивали с помощью индекса площади поражения при пузырчатке (pemphigus disease area index (PDAI)).

Группу контроля составили 10 здоровых лиц, от которых были получены биоптаты кожи. Группы больных пузырчаткой и здоровых лиц статистически не отличались по полу и возрасту.

У всех больных после подписания информированного добровольного согласия на медицинское вмешательство методом панч-биопсии (диаметр — 6 мм) под местной анестезией 2 % раствором лидокаина были получены биоптаты кожи. Учитывая отсутствие данных относительно исследований экспрессии белка PERP у больных, нами был проведен сравнительный анализ результатов непрямой реакции иммунофлуоресценции (н-РИФ) биоптатов, полученных с различных участков кожи (пузырь, участок кожи, прилегающий к пузырю, и видимо здоровая кожа), у 30 больных пузырчаткой. У 11 пациентов был биопсирован пузырный элемент с участком прилегающей видимо непораженной кожи, у 19 больных — участок видимо здоровой кожи. У здоровых лиц биоптаты кожи были получены при проведении хирургических операций.

Для изучения экспрессии белка PERP биоптаты больных и здоровых лиц помещали в салфетку, смоченную физиологическим раствором, в течение 30 минут после иссечения доставляли в патоморфологическую лабораторию, где их заливали в среду для замораживания «Tissue-Tek» («Sakura», Netherlands) и помещали в морозильную камеру при температуре –30 °С. На криостатном микротоме «Slee» (Германия) изготавливали срезы толщиной 5–6 мкм, монтировали их на предметных стеклах с полилизиновым покрытием «Vision biosystems plus slides» (Великобритания), высушивали при комнатной температуре в течение 30 мин. После полного высыхания стекла со срезами помещали в фольгу и хранили в морозильной камере при температуре –30 °С. Постановку н-РИФ осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к антителам. По окончании промывания срезы слегка подсушивали, заключали под покровное стекло в среду, содержащую DAPI, помещали в планшет-папку во избежание выцветания флуорохрома.

Готовые препараты изучали с использованием системы анализа изображений, включавшей конфокальный лазерный сканирующий микроскоп «Olympus IX81S1F-S» (Германия), оснащенный фотомикрографической системой, и персональный компьютер на базе «Intel Pentium 4» с программным обеспечением «Olympus Fluoview Ver. 1.7b».

В каждом биоптате анализировали 5 полей зрения, выбранных подряд, с использованием объектива ×20. В поле зрения выделяли область эпидермиса, в которой наблюдалась экспрессия белка PERP. Программа выдавала цифровое значение (в условных единицах) среднего показателя интенсивности свечения по заданному каналу в выделенной области (рис. 1). Затем рассчитывали средний показатель экспрессии PERP для каждого биоптата.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление