Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер
3 номер 4 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2015, № 1

Подписаться на 2018 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1'2015

Повышение уровня цитокинов и стресс-индуцированных молекул MICA в сыворотке крови больных раком желудка и толстой кишки

Е.В. Абакушина, Д.Н. Абакушин, Г.С. Неприна, И.А. Пасова, Б.А. Бердов, А.В. Клинкова, Е.И. Коваленко, А.Д. Каприн

Целью исследования явилась сравнительная оценка уровня цитокинов IFNγ и TNFα и стресс-индуцированных молекул MICA в сыворотке крови больных раком желудка и толстой кишки. С помощью иммуноферментного анализа содержание цитокинов и MICA было определено в сыворотке крови 57 онкологических больных и 60 здоровых добровольцев. Методом проточной цитофлуориметрии оценена экспрессия рецептора NKG2D и проанализирован состав лимфоцитов периферической крови. При раке желудка и раке толстой кишки средний уровень циркулирующего MICA значительно превышал контрольные значения. Концентрация IFNγ и TNFα в сыворотке крови у этих больных также была повышена. Обнаружено, что как у больных раком желудка, так и больных раком толстой кишки, в периферической крови увеличена доля NK-клеток и экспрессия активирующего рецептора NKG2D. Полученные данные свидетельствуют об активации эффекторного звена иммунитета у данных категорий больных и отсутствии необходимости назначения препаратов цитокиного ряда большинству больных раком желудка и раком кишечника. (Цитокины и воспаление. 2015. Т. 14. № 1. С. 63–67.)

Ключевые слова: рак желудка, рак толстой кишки, стресс-индуцированные молекулы MICA, NK-клетки, IFN-gamma, TNF-alpha.

Одно из первых мест в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями занимают рак желудка и рак кишечника [6]. Это связано с тем, что большинство больных при первичном обращении к врачу уже имеют запущенную стадию заболевания, что снижает возможности лечения. Актуальными задачами остаются ранняя диагностика и подбор адекватного лечения таких больных. В связи с развитием биотехнологии и иммунологии все большее значение в терапии онкологических заболеваний приобретают комплексные подходы с использованием иммунотерапевтических методов, которые направлены на активацию противоопухолевой активности и усиление эффекторного звена иммунного ответа [4]. Одними из первых в противоопухолевой защите организма выступают натуральные киллеры, или NK-клетки. Важными функциями NK-клеток являются цитолитическая активность по отношению к клеткам-мишеням и секреция цитокинов и хемокинов, регулирующих иммунный ответ [3]. Для активации натуральных киллеров необходим комплекс сигналов, поступающих от трансформированных клеток. Одним из последствий активации сигнальных каскадов в опухолевой клетке является экспрессия на клеточной поверхности так называемых стресс-индуцированных молекул MICA и MICB, относящихся к семейству неканонических молекул гистосовместимости класса I (MHC class I-related molecules) [11, 12]. Показано, что экспрессия этих молекул активируется в результате повреждающих ДНК воздействий, а также в результате аномального пролиферативного сигнала, возникающего при активирующих мутациях в киназных доменах цитоплазматической части рецепторов ростовых факторов [10, 12]. Более того, известно, что при неоплазиях экспрессия этих молекул является одним из самых ранних событий, проявляющихся в процессе злокачественной трансформации клеток [12]. Представленные на клеточной поверхности стресс-индуцированные молекулы распознаются рецептором NKG2D, который несет подавляющее большинство NK-клеток и γδT-лимфоцитов, а также значительная часть CD8+ αβT-лимфоцитов [2, 9, 13]. Стресс-индуцированные молекулы MICA являются ранними маркерами для противоопухолевого иммунного ответа. Злокачественные клетки способны сбрасывать эти молекулы со своей поверхности, что помогает им уйти от иммунного надзора. Растворимые формы молекул MICA (sMICA) могут быть обнаружены в сыворотке крови онкологических больных на ранних стадиях заболевания [1, 2]. Возможно, белок MICA может послужить одним из ранних диагностических маркеров, поиск которых является актуальной задачей в онкологии.

Наличие MICA-положительных опухолевых клеток в организме больного должно приводить к активации NKG2D-положительных цитотоксических лимфоцитов и увеличению ими продукции гамма-интерферона (IFNγ), цитокина, вырабатываемого многими активированными лимфоцитами, и фактора некроза опухоли (TNFα). TNFα оказывает непосредственное цитотоксические влияние на многие опухоли, а также обладает иммуномодулирующим и провоспалительным действиями. Продукция этого важного фактора противоопухолевой защиты активированными в процессе иммунного ответа моноцитами и макрофагами может, в свою очередь, также оказывать влияние на выработку цитокинов NK-клетками. IFNγ и TNFα принадлежат к семействам цитокинов, обладающих множественными биологическими функциями [8]. Продемонстрирована эффективность этих цитокинов в терапии больных с различными злокачественными новообразованиями [5]. Изучение роли цитокинов в лечении злокачественных опухолей является одним из современных направлений развития онкологии. В результате иммунологических исследований получены сведения о биологических эффектах интерферонов, IL-2, фактора некроза опухоли и др. Показана их роль в противоопухолевом лечении [7]. При этом наиболее важной задачей остается разработка рациональных режимов применения цитокинов. В клинической практике определение содержания TNFα имеет диагностическое значение в плане понимания процессов, происходящих в организме человека при онкологических заболеваниях. Препараты на основе IFNγ и TNFα привлекают внимание в отношении возможностей повышения эффективности противоопухолевого лечения, однако необоснованное применение цитокинов и использование их препаратов в высоких дозах может привести к ряду негативных эффектов терапии. Поэтому необходимо знать исходный уровень данных цитокинов у пациентов до начала лечения.

Целью данного исследования была сравнительная характеристика уровней циркулирующих стресс-индуцированных молекул MICA, цитокинов IFNγ и TNFα, а также содержания NK-клеток и экспрессии на них активирующих рецепторов NKG2D в крови больных раком желудка и кишечника.

Материалы и методы

В качестве биологического материала использовали периферическую кровь взрослых онкологических больных, проходящих лечение в ФГБУ Медицинский радиологический научный центр. Для включения пациентов в исследование были использованы следующие критерии: 1) возраст старше 18 лет; 2) гистологически подтвержденный диагноз: рак желудка или рак толстой кишки; 3) отсутствие предшествующего лечения онкологического заболевания (химиотерапия, лучевая терапия, хирургическое лечение). В ходе работыоценивали уровни цитокинов и молекул MICA у 57 первичных больных с гистологически подтвержденным диагнозом: рак желудка — 19 больных (T1-4N0-3M0-1) в возрасте 46–80 лет, рак толстой кишки — 38 человек (T2-4N0-2M0-1) в возрасте 42–82 лет. Контрольную группу составили 60 здоровых добровольцев.

Содержание белка sMICA в сыворотках крови определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора антител («R&D Systems», США). В лунки 96-луночного планшета (Immuno Maxi-Sorp, «Nunc») вносили мышиные антитела к белку MICA (Capture Antibody, 2 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи, затем три раза промывали лунки фосфатным буферным солевым раствором с pH 7,2 (PBS), содержащим 0,05 % Tween 20. Для уменьшения неспецифического связывания в лунки вносили блокирующий буфер, содержащий 1 % бычьего сывороточного альбумина и инкубировали 1 ч с последующей отмывкой. В подготовленные таким образом лунки наносили стандартные образцы рекомбинантного белка MICA известной концентрации и исследуемые образцы сыворотки крови больных и здоровых доноров, инкубировали в течение 2 ч и отмывали. Затем в каждую лунку вносили биотинилированные козьи антитела к другому эпитопу белка MICA («Detection Antibody», 400 нг/мл), инкубировали в течение 2 ч, далее лунки промывали. Затем добавляли в каждую лунку раствор конъюгата стрептавидина с пероксидазой из корней хрена (1:200) и инкубировали 20 мин в темноте с последующей отмывкой. Цветную ферментативную реакцию проводили в присутствии перекиси водорода и субстрата ТМБ (3, 3', 5, 5'-тетраметилбензидин) в течение 20 мин, планшет держали в темноте. Затем останавливали ферментативную реакцию, добавляя в каждую лунку 2 N раствор серной кислоты. Измерение оптической плотности образцов проводили при длине волны 450 нм на планшетном фотометре «Multiskan MCC/340 MK II Titertek» («Flow Lab», США).

Содержание цитокинов IFNγ и TNFα в сыворотках крови определяли с помощью ИФА с использованием набора реагентов «Альфа–ФНО-ИФА-БЕСТ» и «Гамма-ИФН-ИФА-БЕСТ» («Вектор Бест», Россия). По стандартным образцам строили калибровочную кривую с помощью которой вычисляли концентрацию белков в исследуемых образцах сывороток крови больных и здоровых доноров.

Периферические мононуклеары (ПМН) выделяли из гепаринизированной венозной крови пациентов и здоровых добровольцев по стандартной методике на градиенте плотности фиколла 1,077 г/см3. Для фенотипирования ПМН использовали флуоресцентно меченые антитела к CD3, CD16, CD56 («Beckman Coulter», Франция). Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили в PBS, содержащем 1 % эмбриональной телячьей сыворотки и 0,02 % NaN3 в течение 30 мин при 4 оС с последующей двукратной отмывкой PBS путем центрифугирования. Оценку поверхностной экспрессии NKG2D в популяции ПМН проводили с использованием антител CD314 («eBioscience», США). Цитометрические измерения проводили на проточном цитофлуориметре «FACScan» («Becton Dickinson», США). Анализировали не менее 10000 событий в экспериментах по анализу экспрессии поверхностных маркеров. Обработку полученных результатов проводили с помощью программы «CellQuest».

Статистический анализ различий данных, полученных в разных группах, проводили по методу Манна — Уитни с использованием программного обеспечения «SigmaPlot 11.0».

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление