Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2015, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2015

Оценка экспрессии гена Toll-подобного рецептора 4 в слизистой оболочке верхних дыхательных путей

Е.В. Тырнова, Г.М. Алешина, Ю.К. Янов, В.Н. Кокряков

Проведена оценка экспрессии гена Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) в поверхностном эпителии слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Исследовали 210 образцов операционного материала: слизистая оболочка носа и верхнечелюстных пазух (нижние носовые раковины, слизистая среднего носового хода, полипы), барабанной и мастоидальной полости, гортани, аденоиды, небные миндалины. Оценку экспрессии генов TLR4 и бета-актина по уровню синтеза соответствующих мРНК проводили методом обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени. Экспрессия гена TLR4 установлена в большинстве образцов ткани аденоидов и небных миндалин, в единичных образцах слизистой носа и верхнечелюстных пазух, среднего уха, отсутствовала во всех образцах эпителия гортани. Различия экспрессии TLR4 могут свидетельствовать о функциональной модуляции системы врожденного иммунитета в специфических анатомических областях. Вероятно, имеет место контроль активации эпителиального TLR4 в целях поддержания гомеостаза слизистой оболочки верхних дыхательных путей и предотвращения непреднамеренной и/или избыточной стимуляции локального воспаления. (Цитокины и воспаление. 2015. Т. 14. № 2. С. 35–41 .)

Ключевые слова: слизистая оболочка верхних дыхательных путей, Toll-подобный рецептор 4, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Врожденные защитные механизмы раннего (немедленного) распознавания микробов играют первостепенную роль в инициальном контроле инфекций и оказывают воздействие на характер и масштабы последующих реакций адаптивного иммунитета. Первоначальная детекция микробов в значительной степени зависит от паттерн-распознающих рецепторов (PRR), лигандами которых являются патоген-ассоциированные молекулярные паттерны или микробо-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP и MAMP, соответственно) [10]. PRR-зависимые реакции системы врожденного иммунитета определяют интенсивность протекания воспалительных процессов, завершающихся клиренсом микробов [1, 11]. PRR широко экспрессируются множеством иммунных клеток (таких как нейтрофилы, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, лимфоциты) и большинством эпителиальных клеток.

Первым идентифицированным классом паттерн-распознающих рецепторов стали Toll-подобные рецепторы (TLR) [13]. TLR функционируют совместно с другими PRR и запускают механизмы врожденного иммунитета, в том числе, связанные с воспалением.

Toll-подобные рецепторы конститутивно экспрессированы в моноцитах, макрофагах и дендритных клетках, определенные TLR также экспрессированы в других типах клеток, таких как нейтрофилы, тучные клетки, эпителиальные клетки и B клетки [11]. Активация TLR ведет к продукции биологически активных веществ, которые формируют воспалительные и иммунные реакции организма.

Первый гомолог Toll-рецепторов у человека открыт в 1997 г. и получил название hToll [13]. hToll активировал транскрипционный фактор NF-κB, индуцировал выработку провоспалительных цитокинов и костимулирующих молекул. Дефицитные по одноименному рецептору мыши были неспособны продуцировать провоспалительные цитокины в ответ на липополисахарид (ЛПС). Рецептор hToll, позже названный TLR4, был первым охарактеризованным членом семейства TLR.

TLR4 признан в качестве ведущего рецептора к ЛПС грамотрицательных бактерий. Составной элемент ЛПС липид A служит основным лигандом рецептора TLR4 и определяет токсичность больших концентраций ЛПС, вызывающего избыточный синтез TNFα и IL-1β, лихорадку, диарею и септический шок. TLR4 также может распознавать широкий спектр структурно неродственных лигандов, в частности, белки теплового шока, гликопротеины, белок слияния респираторно-синцитиального вируса, дитерпены растений и химиотерапевтический препарат паклитаксел.

TLR4 локализован на поверхности клеток, является трансмембранным белком I типа с богатыми аминокислотой лейцином повторами во внеклеточном N-терминальном домене. Внутриклеточная C-терминальная часть содержит общий для всех членов семейства домен TIR (Toll/interleukin-1 receptor).

Известно, что TLR4 использует два основных сигнальных пути (MyD88-зависимый и MyD88-независимый), опосредованных различными содержащими TIR-домен адапторными молекулами, и ведущих посредством активации MAP-киназы и NF-κB к индукции выработки моноцитами и дендритными клетками провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-12p40 и TNFα). Появляются свидетельства того, что сигнальные пути PRR могут при определенных условиях поддерживать противовоспалительные реакции [6, 11].

MyD88-независимый TRIF-зависимый сигнальный путь индуцирует продукцию провоспалительных цитокинов, а также интерферонов I типа посредством IRF3. Показано также, что ЛПС индуцирует продукцию противовоспалительного цитокина IL-10 в совместной культуре T-клеток со стимулированными дендритными клетками, а также в праймированных дендритных клетках, но не предупреждает аллергическое воспаление дыхательных путей [5]. Совместная стимуляция двумя типами ЛПС приводила к сниженной выработке провоспалительных цитокинов и повышению продукции IL-10 вследствие комбинации низкой иммуностимулирующей активности, а также конкуренции за рецептор TLR4, что свидетельствует о потенциальной роли ЛПС комменсальных бактерий в поддержании иммунного гомеостаза и предупреждении воспалительных заболеваний [12].

Переключение используемой адапторной молекулы ассоциировано с изменением паттерна экспрессии цитокинов, при этом для полноценной выработки как провоспалительных цитокинов, так и IL-10 необходимо присутствие обоих адапторов MyD88 и TRIF [11].

Важным фактором дифференциации про- и противовоспалительного сигнальных путей считают клеточный компартмент, где проходит сигнальный путь TLR4. В противоположность провоспалительному MyD88-зависимому сигнальному пути TLR4 на поверхности клетки, TRIF-зависимый сигнальный путь TLR4 из эндосомального компартмента индуцирует секрецию противовоспалительного цитокина IL-10 [6].

Свойство рецепторов врожденного иммунитета индуцировать продукцию не только провоспалительных, но также противовоспалительных цитокинов позволяет настраивать иммунные реакции на микробов, экспрессирующих определенные PAMP, в результате чего во внутренней среде и на слизистых оболочках макроорганизма скорее устанавливается состояние комменсального сосуществования, чем развивается инфекционное заболевание [11].

Целью настоящей работы явилась оценка экспрессии гена Toll-подобного рецептора 4 на основе определения мРНК в поверхностном эпителии слизистой оболочки верхних дыхательных путей больных хроническими воспалительными заболеваниями носа и околоносовых пазух, носоглотки, среднего уха и гортани.

Материалы и методы

Операционный материал от больных хроническими воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей, полученный во время планового хирургического вмешательства в условиях общей анестезии (таблица), немедленно помещали в стабилизирующий раствор RNAlater («Ambion») в соотношении 1:5 и сохраняли при температуре -20°С до проведения молекулярно-генетических исследований.

Исследовано 210 образцов операционного материала от 201 больного. В качестве контрольной ткани служили нижние носовые раковины больных с искривлением перегородки носа, обычно используемые в литературе с этой целью. Вторым контролем служили образцы здоровой ткани слизистой оболочки среднего носового хода, полученные попутно в ходе операций. Хирургическое лечение проведено больным в период вне обострения заболевания.

Общую РНК выделяли согласно протоколу «Gen Elute Mammalian Total RNA Miniprep Kit» и «On-Column DNase I Digestion Set» («Sigma-Aldrich») из поверхностного эпителия исследуемых образцов ткани. Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы M-MLV («Promega») в присутствии oligo(dT) и dNTPs («Медиген»). Амплификацию проводили с использованием специфических праймеров 5'-ctgcaatggatcaaggacca-3' (прямой) и 5'-ttatctgaaggtgttgcacattcc-3' (обратный) и реактивов «iQTM SYBR Green Supermix» («Bio-Rad Laboratories», США) методом ПЦР в режиме реального времени с помощью системы детекции продуктов ПЦР в реальном времени CFX96 Touch™ и программного обеспечения CFX Manager™ версия 2.1 («Bio-Rad Laboratories», США») [8]. Режим проведения реакции амплификации: инициальный нагрев 5 мин при t=95 °С, затем 40 циклов: 10 с при t=95 °С, 1 мин при t=60 °С. В трети случаев из общей РНК с использованием специфических праймеров и реактивов «iScript™ One-Step RT-PCR Kit With SYBR® Green» («Bio-Rad Laboratories», США) проведена совмещенная (одностадийная) обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени (синтез кДНК и амплификация выполняются в одной пробирке) с использованием того же оборудования [8]. Режим проведения реакции амплификации: 10 мин при t=50 °С, 5 мин при t=95 °С, затем 40 циклов: 10 с при t=95 °С, 1 мин при t=60 °С. Уровни экспрессии гена TLR4 относительно гена внутреннего контроля бета-актина (прямой праймер 5'-gggtcagaaggattcctatg-3', обратный 5'-gggtcagaaggattcctatg-3') оценивали с помощью программы сравнения, встроенной в программное обеспечение прибора.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы «Prism 5» («GraphPad») методами описательной статистики с использованием непараметрического критерия различия (тест Манна — Уитни). Значения p<0,05 рассматривали как статистически значимые.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление