Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2015, № 3

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 3'2015

Орексин-А- и орексин-В-содержащие нейроны гипоталамуса крыс после введения липополисахарида

В.А. Пугач, С.В. Перекрест, Н.С. Новикова, Е.А. Корнева

Исследовали участие орексин-А- и орексин-В-содержащих нейронов гипоталамуса крыс Wistar в реализации реакций мозга на введение липополисахарида (ЛПС). Через 1 ч после введения ЛПС или физиологического раствора (контроль) животных выводили из опыта посредством интракардиальный перфузии для дальнейшего иммуногистохимического выявления орексин-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса (дорсомедиальное ядро (DMH), зоны латеральной гипоталамической области: юкстадорсомедиальной (LHAjd), супрафорникальной (LHAs) и дорсальной (LHAd)). Полученные данные позволяют заключить, что орексин-А- и орексин-В-содержащие нейроны отвечают на введение ЛПС изменением количества визуализированных нейронов и их относительной оптической плотности (ООП). Через 1 ч после введения ЛПС количество орексин-А-содержащих нейронов увеличивается только в LHAs, а орексин-В-содержащих нейронов — в DMH, LHAjd, LHAs. ООП орексин-А-позитивных нейронов снижается во всех исследуемых структурах. При анализе ООП нейронов, содержащих орексин В, отмечается разнонаправленность реакции гипоталамических структур в ответ на инъекцию ЛПС, т. е. в DMH констатировано снижение ООП, а в LHAjd и LHAs — ее увеличение. Т. о., можно заключить, что популяция орексин-А- и орексин-В-содержащих нейронов функционально гетерогенна, т. к. нейроны, локализованные в различных гипоталамических структурах, по-разному отвечают на введение ЛПС. (Цитокины и воспаление. 2015. Т. 14. № 3. С. 71–75.)

Ключевые слова: нейроиммунные взаимодействия, гипоталамус, орексины А и В, липополисахарид.

Орексины А и В (OxA, OxB) — нейропептиды, которые синтезируются небольшой популяцией гипоталамических нейронов из общего предшественника препроорексина. Нейроны, содержащие эти нейромедиаторы, вовлечены во многие физиологические процессы, включая терморегуляцию, цикл сон/бодрствование, болевое восприятие и пищевое поведение [5]. Известно, что нарушения этих процессов происходят при развитии ответа острой фазы, который клинически проявляется как продромальный симптомокомплекс. Первостепенное значение в развитии продромального синдрома имеют провоспалительные цитокины (IL-1, IL-6, TNFα), которые активируют клетки центральной нервной системы (ЦНС), в основном, в результате проникновения через гематоэнцефалический барьер [8]. Одним из индукторов синтеза цитокинов является компонент клеточной стенки грам-отрицательных бактерий — липополисахарид (ЛПС). Известно, что инъекция ЛПС вызывает морфофункциональные изменения орексинсодержащих нейронов, причем характер реакции этих нейронов зависит от дозы, способа и кратности введения ЛПС. Так, однократное внутривенное введение ЛПС (25 мкг/кг) крысам через 2 и 4 ч приводит к увеличению количества орексин-позитивных нейронов, а затем к снижению их количества в структурах гипоталамуса (через 6 ч после инъекции), что обусловлено повышением или снижением содержания орексинов в клетке [10]. При введении большей дозы ЛПС (500 мкг/кг) изменения наблюдаются только через 6 ч после инъекции в сторону снижения общего количества визуализированных орексин-содержащих нейронов [1]. В экспериментах на мышах показано, что внутрибрюшинные еженедельные инъекции ЛПС (100 мкг/кг) вызывают постепенное снижение количества орексин-содержащих нейронов через 4, а затем через 8 недель. Количество нейронов, содержащих орексины, возвращалось к контрольным величинам только через 30 дней после последней инъекции ЛПС [9]. Применение в экспериментах метода сочетанного выявления орексинов и общепризнанного маркера активации нейрональных клеток белка с-Fos позволяет судить о вовлечении орексин-содержащих нейронов в ответные реакции гипоталамических структур на поступление в ЦНС информации о введении ЛПС. Gaykema R.P. и Goeler L.E. показали увеличение количества c-fos-позитивних OxА-содержащих нейронов через 1,5–2 ч после внутрибрюшинной инъекции ЛПС (100 мкг/кг) крысам. Вместе с тем, предварительное введение ЛПС снижало вызванную исследовательским поведением активацию этих нейронов (тестирование в приподнятом крестообразном лабиринте) [12]. С другой стороны, есть работы, в которых изучены эффекты хронического введения ЛПС (0,22 мкг/ч) в зоны латерального гипоталамуса крыс. Авторами показано снижение количества орексин-содержащих нейронов через 30 дней, обусловленное их гибелью в результате воспалительной реакции [11]. Литературные данные позволяют заключить, что система орексин-содержащих нейронов вовлекается в механизмы реализации реакций ЦНС на введение ЛПС. Однако все проведенные исследования посвящены изучению изменения количества OxА-содержащих нейронов, а участие нейронов, содержащих OxВ, в центральных механизмах реализации нейроиммунных взаимодействий не изучено.

Цель настоящей работы — исследование участияOxА- и OxВ-содержащих нейронов в механизмах реализации реакций головного мозга на введение ЛПС.

Материалы и методы

Работа выполнена на 10 крысах, взрослых самцах породы Wistar, весом 200–250 г. Животных содержали в условиях вивария, при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище, на стандартной диете в соответствии с нормами содержания лабораторных животных. Инъекции ЛПС (E.coli 055:B5, «Sigma», L2880) проводили в 11:00 с целью нивелирования различий, связанных с суточными колебаниями содержания орексинов в гипоталамусе [12]. ЛПС вводили внутривенно (v. caudalis) в дозе 500 мкг/кг в 200 мкл физиологического раствора. В качестве контроля использовали крыс, которым внутривенно вводили физиологический раствор в том же объеме. Через 1 ч после инъекций животных наркотизировали пентобарбиталом (в/б, 60 мкг/кг веса). Далее проводили интракардиальную перфузию сначала теплым физиологическим раствором (37 °C), содержащим гепарин (10 ЕД/мл), затем охлажденным раствором фиксатора (+4 °С) (100 мл 4 % раствора параформальдегида на 0,1 М фосфатно-солевом буфере + 0,2 % раствор пикриновой кислоты, рН 7,4). Головной мозг извлекали через 2 ч после перфузии и погружали в свежий раствор фиксатора (без добавления пикриновой кислоты), который содержал 15 % сахарозу. Дофиксацию мозга осуществляли в течение 12 ч при температуре +4 °С. На замораживающем микротоме (t=-28 °C) изготавливали фронтальные срезы головного мозга (толщина — 30 мкм) для последующего иммуногистохимического исследования. В качестве первых антител использовали козьи антитела к орексину А (1:400) («SantaCruzBiotechnology») и к орексину В (1:400) («SantaCruzBiotechnology»), а в качестве вторых — ослиные анти-козьи антитела, конъюгированные с биотином (1:400) («SantaCruzBiotechnology»), детекцию которых проводили при помощи авидин-пероксидазной метки. Визуализацию иммуногистохимической реакции производили раствором 3´3-диаминобензидина. Далее изготавливали постоянные гистологические препараты. Выявление OxА- и OxВ-позитивных нейронов проводили при 10-кратном увеличении светового микроскопа на срезах, соответствующих 28, 29, 30 уровням головного мозга, поскольку именно на этих уровнях локализовано наибольшее количество клеток, содержащих орексины [11]. Подсчет нейронов, содержащих OxА и OxВ, а также определение их относительной оптической плотности (ООП) осуществляли при помощи компьютерной программы «VideoTestMaster» в дорсомедиальном ядре гипоталамуса (DMH) и в зонах латеральной гипоталамической области (LHA): юкстадорсомедиальной (LHAjd), супрафорникальной (LHAs) и дорсальной (LHAd). ООП рассчитывали по следующей формуле:

ООП=средняя опт. плотность нейронов / средняя опт. плотность фона.

Последующую статистическую обработку полученных данных выполняли методами описательной статистики. Сравнение групп экспериментальных животных проводили при помощи t-критерия Стьюдента в программе «Statistica», построение диаграмм — в программе «Microsoft Excel 2010».

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление