Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер
3 номер 4 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2015, № 3

Подписаться на 2018 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 3'2015

Особенности патогенеза острого одонтогенного остеомиелита

А.М. Настуева, З.Ф. Хараева, М.Ш. Мустафаев

Выявленный дефицит внутриклеточных радикалов у пациентов с острым очаговым одонтогенным остеомиелитом челюстей приводит к неэффективному внутриклеточному киллингу патогенов. Дисбаланс в системе «прооксиданты – антиоксиданты» проявляется сниженным уровнем антиоксидантной активности плазмы крови. Высокий уровень провоспалительных цитокинов не имеет тенденции к нормализации на фоне проводимой терапии. (Цитокины и воспаление. 2015. Т. 14. № 3. С. 90–94.)

Ключевые слова: одонтогенный остеомиелит, цитокины, свободные радикалы.

Остеомиелит челюстно-лицевой области характеризуется тяжелым клиническим течением, длительностью и сложностью лечения, высоким процентом осложнений, зачастую приводящих к формированию значительных функциональных и эстетических нарушений. Отмечается тенденция к росту случаев затяжного течения заболевания [1, 2]. Между тем, большинство исследований остеомиелита отечественных авторов посвящены изучению хронической формы нозологии, чаще травматической этиологии [4, 10, 12]. Современные аспекты патогенеза и лечения острого одонтогенного остеомиелита челюстно-лицевой области мало освещены.

В последние годы появились новые данные об участии цитокин- и радикал-опосредованных механизмах формирования иммунной недостаточности при хирургической инфекции [8, 9, 11]. Признано, что типы иммунного ответа связаны с одним из вариантов активации лимфоцитов с преимущественным участием Т-лимфоцитов-хелперов типа 1 (Тh1) или 2 (Тh2). Активация Тh1, секретирующих интерлейкин 2 (IL-2) и интерферон гамма (IFNγ), стимулирует развитие ответа клеточного типа, в то время как синтезируемые Тh2-клетками цитокины IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 стимулируют гуморальный ответ. В первую фазу ранозаживления наиболее значима роль провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, фактора некроза опухоли α (TNFα), IFNγ. При недостаточном количестве иммуноцитокинов данной группы процесс ранозаживления имеет вялотекущий характер. Провоспалительные цитокины играют защитную роль, поскольку обеспечивают рекрутирование в очаг инфекции эффекторных клеток (нейтрофилов, макрофагов), стимулируют их фагоцитарную, бактерицидную активность и индуцируют запуск антиген-специфического иммунного ответа, что в совокупности способствует элиминации патогена [5].

Также установлена тесная взаимосвязь между многими патологическими состояниями и процессами усиленного образования радикалов, что сопровождается повреждением собственных органов и тканей. Антирадикальная защитная система предотвращает вызванную радикалами самодеструкцию клеток фагоцитов и воспалительное повреждение подлежащих тканей и представлена рядом антиоксидантов, способных детоксицировать свободные формы кислорода, такие как супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза, токоферолы, каротиноиды и другие. Внутриклеточный окислительно-восстановительный баланс является регуляторным фактором в процессах Т-клеточной активации, секреции цитокинов макрофагами, а также клеточной гибели по апоптозному типу. Гибель Т-клеток путем апоптоза, через окислительный стресс может быть вызвана TNF — лимфокином, секретируемым, главным образом, макрофагами и Т-клетками [10]. Чувствительность либо резистентность Т-клеток к действию TNF совпадает с повышением или снижением уровня СОД [10].

Цель исследования: изучение активности эффекторных функций нейтрофилов и цитокинового статуса пациентов с острым очаговым одонтогенным остеомиелитом и установление их прогностической значимости.

Материалы и методы

Обследованы 32 пациента с острым очаговым одонтогенным остеомиелитом нижней челюсти (14 женщин, 18 мужчин в возрасте от 26 до 47 лет), госпитализированных в отделение челюстно-лицевой хирургии Республиканской клинической больницы города Нальчика. Пациентам экстренно проводили хирургическое вмешательство, состоявшее в удалении причинного зуба, проведении двусторонних разрезов в полости рта, антибактериальной терапии, включавшей назначение антибиотиков, тропных к костной ткани (линкомицин, тетрациклин, фузидин) и широкого спектра действия (цефалоспорины). Уменьшения общей интоксикации, улучшение реологических свойств крови достигали посредством применения антикоагулянтов прямого действия (гепарин), парентерального введения реополиглюкина, глюкозы, солевых растворов. Проводили десенсибилизирующую и физиотерапию. Контрольную группу составили 35 здоровых доноров в возрасте от 20 до 40 лет.

Для выделения нейтрофилов использовали венозную кровь, взятую утром натощак путем пункции локтевой вены больных и доноров в строго асептических условиях. Кровь собирали в стерильные силиконизированные пробирки, содержавшие 1,0 мл антикоагулянта — раствора гепарина («Richter», Венгрия) (25 единиц на 1,0 мл крови). Количество используемой крови на одно исследование составляло от 5 до 10 мл. Нейтрофилы выделяли по стандартной методике на двойном градиенте плотности. Для этого в силиконизированные пробирки поэтапно наслаивали равные объемы растворов фиколла – верографина (удельная плотность — 1,199 г/см3 и 1,080 г/см3) и периферическую кровь. Затем пробирки центрифугировали в течение 40 минут при 800 g в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования нейтрофилы концентрировались в интерфазном кольце. Взвесь нейтрофилов переносили в силиконизированные пробирки и дважды отмывали раствором Хенкса (рН 7,4). Режим центрифугирования — 10 минут при 400 g. Подсчитывали и доводили до рабочей концентрации 106 кл/мл.

Внутриклеточную генерацию радикалов исследовали с помощью флуоресцентного красителя гидроэтидина [3]. Матричные растворы флуорохрома готовили в диметилформамиде и хранили при температуре -18 оС.

Нейтрофилы инкубировали в растворе Хенкса (без фенолового красного, pH 7,4) 15 минут с 10-4 М гидроэтидина, отмывали центрифугированием (5 мин при 800 g и +4оC) в избытке раствора Хенкса и окончательно ресуспендировали до концентрации 106 кл/мл. После этого клетки стимулировали форболмиристатацетатом (ФМА), 10-5 М. Образование этидиума из гидроэтидина в клетках регистрировали, измеряя интенсивность флуоресценции этидиума при длинах волн возб.=473 нм, исп.=610 нм на спектрофлуориметре «MPF-44» («Perkin-Elmer») в сантиметровых кварцевых кюветах, термостатированных при 37 °С и постоянном перемешивании. Для расчета изменения генерации АФК под действием изучаемых препаратов был введен параметр F:

F=..., где

I0 — интенсивность люминесценции этидиума в опыте;

Ik — интенсивность люминесценции этидиума в контроле

Внеклеточную генерацию супероксидрадикала, генерируемого нейтрофилами, регистрировали методом, основанным на реакции восстановления супероксидом цитохрома С [13]. Исследовали спонтанную и индуцированную продукцию супероксидрадикала. Для исследования индуцированной в инкубационную смесь объемом 1 мл, содержавшую 100 мкл суспензии нейтрофилов (106/мл) в растворе Хенкса (рН 7,4) и 50 мкл цитохрома C (12,5 мг/мл), добавляли 10 мкл ФМА (10-6 М). Спонтанную продукцию супероксидного радикала измеряли путем добавления 10 мкл диметилсульфоксида (99 %) вместо ФМА. Для выяснения вклада в реакцию восстановления цитохрома C именно супероксидного радикала в реакционную смесь добавляли 10 мкл Cu-Zn-СОД (0,5 мг/мл). Приготовленные таким образом пробы инкубировали при периодическом перемешивании в течение 1 ч при температуре 37 °С. Затем суспензии центрифугировали 10 минут при 400 g, после чего измеряли оптическое поглощение супернатанта при 550 нм (А550) и выражали в нМ/мин с учетом показателя экстинкции восстановления цитохрома C(ε = 21 мМ-1 см-1).

Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали стандартным методом в отношении бактерий Staphylococcus aureus, выделенных у каждого больного [7]. Для этого смешивали 1 мл суспензии нейтрофилов и 1 мл взвеси бактерий (107 кл) в растворе Хенкса (рН 7,4). Смесь инкубировали при помешивании 30 мин при температуре 37 °С. Приготавливали мазки на стекле, фиксировали и окрашивали по Романовскому — Гимза. В мазках подсчитывали количество фагоцитирующих макрофагов на 100 клеток. Полученные данные выражали в виде фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа.

Оценку эффективности внутриклеточного киллинга оценивали по методу Nielsen S.L. [14]. После постановки фагоцитарной реакции (см. выше) взвесь центрифугировали 10 минут при 1500 g, отбирали осадок, добавляли трехкратный объем Н2О и производили высев по методу Гольдана в чашку Петри с мясо-пептонным агаром. Число выживших после фагоцитоза бактерий определяли по количеству колоний в секторах через 24 ч.

Антиоксидантную активность (АОА) плазмы крови определяли по методике Клебанова Г.И. [6]. Для этого 100 мкл желточной суспензии добавляли к 100 мкл плазмы и 100 мкл FeSO4, доводя общий объем пробы до 1 мл. Смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Затем в пробирку вносили 0,5мл 20 %-ной трихлоруксусной кислоты и 0,1 мл 10-2 М раствора ионола в спирте. Пробы центрифугировали 10 мин при 1500 g и отбирали супернатант. К 0,7 мл супернатанта добавляли 0,6 мл 0,5 % тиобарбитуровой кислоты и грели на водяной бане, после чего измеряли светопоглощение при А532. Антиоксидантную активность выражали в виде процента от контроля (проба без плазмы) : Аопыт — опытная проба; Аопытспонт — опытная проба без FeSO4; Аконтроль — контрольная проба; Аконтрольспонт — контрольная проба без FeSO4.

Концентрации IL-1β, IL-6, IL-10 и TNFα исследовали в динамике заболевания. Материалом для исследования служила плазма крови и ротовая жидкость. Венозную кровь забирали в стерильные пробирки, содержавшие 1,0 мл антикоагулянта — раствора гепарина («Richter», Венгрия) (25 единиц на 1,0 мл крови). Стабилизированную кровь центрифугировали 10 мин и собирали супернатант. Забор крови осуществлялся на 1, 2, 5, 7, 10, 14-е сутки пребывания в стационаре.

Ротовую жидкость забирали в стерильные пробирки утром без предварительной чистки зубов в первые сутки заболевания и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную часть ротовой жидкости помещали в пластиковые пробирки и хранили при температуре -30 °C. Концентрацию цитокинов в ротовой жидкости и сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с помощью реагентов ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург).

Результаты исследований подвергали статистической обработке с помощью программы «Statistica 7.0». Существенность различий средних величин оценивали по критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление