Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2015, № 4

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 4'2015

Влияние факторов воспаления на трансэндотелиальный транспорт липопротеинов сыворотки крови in vitro

П.Г. Назаров, О.Н. Мальцева, Д.А. Танянский, Е.В. Агеева, Д.В. Бородина, А.Д. Денисенко

Исследовали влияние факторов острой фазы воспаления — C-реактивного белка (CRP) и фактора некроза опухолей альфа (TNFa) — на трансэндотелиальный транспорт (ТЭТ) апоВ-содержащих липопротеинов низкой плотности (апоВ, ЛПНП) и других молекул сыворотки крови человека в двухкамерной системе с пористым дном в верхней камере, покрыты эндотелиальными клетками человека линии EA.hy926. Результаты показали, что CRP в концентрации 200 мкг/мл, соответствующей его уровню в крови в острой фазе воспаления, стимулирует ТЭТ апоВ и основного белка липопротеинов высокой плотности (апоА-1) через 12 ч после добавления к клеткам в верхнюю камеру. ТЭТ IgM под влиянием CRP возрастает позднее, к 24 ч. ТЭТ альбумина был наименее чувствителен к стимуляции CRP и возрастал к 24 ч незначительно. Ускорение ТЭТ апоВ под влиянием CRP ингибировалось аминазином, что указывает на клатрин-зависимый характер эффекта CRP. ТЭТ декстрана 70 кДа, а также ТЭТ альбумина, слабо изменявшийся под влиянием CRP, были нечувствительны к аминазину. ТЭТ апоВ, но не альбумина, ускорялся также под действием TNFa. Активация ТЭТ ЛПНП под действием наиболее распространенных факторов воспаления может являться одним из возможных механизмов проатерогенного действия таких состояний как ожирение, для которого, как известно, характерно длительное повышение содержания в крови как TNFa, так и CRP. (Цитокины и воспаление. 2015. Т. 14. № 4. С. 59–64.)

Ключевые слова: воспаление, атеросклероз, трансэндотелиальный транспорт, липопротеины, апоВ, апоА-1, С-реактивный белок, TNF-alpha.

Накопление аполипопротеин В (апоВ)-содержащих липопротеинов, в первую очередь, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), в интиме артерий является одним из самых ранних событий в атерогенезе [1]. Так как диаметр частиц ЛПНП (20–30 нм) много больше, чем промежутки между эндотелиальными клетками сосудов (gap junctions ~ 3–6 нм), то основным путем трансэндотелиального транспорта ЛПНП в интиму является трансцитоз [11, 20]. На клетках эндотелия есть рецепторы для ЛПНП и скевенджер-рецепторы, которые способны связывать частицы ЛПНП [12]. Известно несколько путей интернализации веществ клетками: клатрин-зависимый эндоцитоз, клатрин-независимый эндоцитоз, рафтовый. Механизм захвата ЛПНП и транспорта через слой эндотелия изучен недостаточно.

Имеются весомые доказательства того, что усиление трансцитоза ЛПНП наблюдается как при экспериментальном атеросклерозе у животных, так и при развитии поражений в коронарных артериях человека [17].

Не вызывает также сомнения, что воспаление является важнейшим участником патогенеза атеросклероза [2]. Достаточно подробно изучены механизмы участия иммуновоспалительных процессов в формировании атеросклеротических поражений [3, 18]. Однако к настоящему времени не ясно, какое влияние оказывают воспалительные медиаторы на транспорт ЛПНП в сосудистую стенку. Так, многочисленные исследования показали наличие положительной связи между концентрацией C-реактивного белка (CRP) и риском развития атеросклероза и его клинических проявлений. Причем, относительный риск развития сердечно-сосудистых катастроф при повышении уровня CRP сравним с таковым для гиперлипидемии и гипертензии [14]. Однако механизмы участия CRP в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний остаются неясными. Возможно, что патогенетическая роль CRP в развитии атеросклеротических поражений заключается в индукции дисфункции эндотелия, данные в пользу этой точки зрения есть в литературе [21]. CRP стимулирует продукцию активных форм кислорода и активирует NF-κB сигнальный путь, что приводит к инициации синтеза ряда хемокинов и адгезионных молекул [4]. Взаимодействию CRP c эндотелием посвящены единичные работы. Так, показано, что на эндотелиальных клетках аорты CRP связывается с FcgRI и FcgRII рецепторами и интернализуется [10]. Влияние CRP на функциональную активность эндотелия, в частности, на трансэндотелиальный транспорт липопротеинов практически не изучено.

В настоящем исследовании было изучено влияние CRP, а также одного из провоспалительных цитокинов — фактора некроза опухоли альфа (TNFa) — на трансэндотелиальный транспорт апоВ-содержащих липопротеинов in vitro.

Материалы и методы

Исследование проводили на эндотелиоцитах линии EA.hy926. Клетки росли в СО2-инкубаторе на бесцветной культуральной среде DMEM (HyClone, № SH30284.01) с 10 % фетальной телячьей сывороткой (ООО «БиолоТ», Россия) на пористых вставках с диаметром пор 1 мкм для 24-луночного планшета («BD Falcon», № 353104), покрытых коллагеном 1-го типа (ООО «БиолоТ», № 1.2.001). Вставки обрабатывали коллагеном следующим образом: раствор коллагена, 70 мкг/мл в 20 мМ уксусной кислоты, выдерживали во вставках в течение 1 ч при комнатной температуре, далее их промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, ООО «БиолоТ») и выдерживали в ФСБ в течение 1 ч. Клетки росли в течение 2–3 сут. до формирования монослоя. В опытах с добавлением ЛПНП и альбумина без сыворотки клетки предварительно инкубировали в DMEM c 5 % бычьим сывороточным альбумином («Sigma», № A-4503) в течение суток. Далее во вставки (в верхние камеры) добавляли по 200 мкл среды DMEM с 5 % человеческой сывороткой (в качестве источника ЛПНП, альбумина и др.), либо с 50 мкг/мл выделенных ЛПНП человека, очищенного человеческого альбумина («Sigma», № A-1653) и декстрана 70 кДа, меченного флуоресцентным красителем FITC («Sigma», F-1628, США). ЛПНП выделяли из сыворотки крови человека методом ступенчатого ультрацентрифугирования в градиенте плотности NaBr (d=1,023–1,055 г/мл) в роторе 70Ti при 38000 об/мин в течение 22 ч на ультрацентрифуге «Beckman Optima L90-K». Выделенные ЛПНП диализовали против ФСБ. Содержание белка определяли BCA-реактивом («Pierce», № 23223). В некоторые вставки дополнительно добавляли 200 мкг/мл CRP («Calbiochem», № 236600) или 50 нг/мл TNFa («Sigma», T0157).

Аминазин (10 мкг/мл, ОАО «Новосибхимфарм», Россия) добавляли в верхние камеры с клетками за 30 мин до инкубации с действующими веществами и далее с ним выдерживали весь срок инкубации. В нижние камеры добавляли по 700 мкл среды DMEM. Инкубации проводили в течение 1, 2, 4, 8, 12, 24 ч.

По 50 мкл аликвот из нижних камер отбирали для определения концентраций апоВ, апоА-1, альбумина (методами иммуноферментного анализа, разработанными в отделе биохимии ФГБНУ «ИЭМ»), IgM (реагентами «IgM общий-ИФА-БЕСТ», ЗАО «Вектор-Бест») и FITC-декстрана (по флуоресценции при 485/528 нм). Трансэндотелиальный транспорт макромолекул, выраженный в процентах, рассчитывали как отношение количества макромолекулы в нижней камере к количеству добавленной макромолекулы, умноженное на 100. Для проверки барьерности эндотелиального монослоя перенос макромолекул также оценивали во вставках, покрытых коллагеном, но без эндотелия.

Статистическую обработку результатов проводили в программе «Microsoft Excel». На каждое условие эксперимента использовали по 3–4 вставки. Данные представлены в виде средних значений c доверительными интервалами, означающими ошибку среднего. Достоверность различий оценивали по непарному t-критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление