Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2015, № 4

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 4'2015

Функциональные свойства фибробластов в культуре под действием различных концентраций гомоцистеина

Е.В. Фефелова, Н.Н. Цыбиков, М.В. Максименя, П.П. Терешков

Изучено влияние различных концентраций гомоцистеина на функционирование фибробластов в культуре клеток (рост, экспрессию белков теплового шока, синтез интерлейкинов). Показано, что наблюдается усиленный рост фибробластов при добавлении в культуральную среду гомоцистеина в концентрациях от 6,3 до 25 мкмоль/л. Зарегистрировано дозозависимое увеличение уровней малонового диальдегида и белков теплового шока 70 и 90. Синтез интерлейкинов фибробластами характеризовался различной интенсивностью: увеличивались концентрации IL-1β, IL-6, IL-4 и снижалась концентрация IL-10. При уровне гомоцистеина 50 мкмоль/л основная масса клеток погибала. (Цитокины и воспаление. 2015. Т. 14. № 4. С. 24–28.)

Ключевые слова: культура фибробластов, гомоцистеин, белки теплового шока, интерлейкины, малоновый диальдегид.

Известно, что повышенный уровень гомоцистеина (ГЦ) является триггером разнообразной патологии [8–10]. ГЦ — это аминотиол, образующийся в ходе взаимопревращений метионина и цистеина. Он обнаруживается в крови преимущественно в комплексе с цистеином белков, а также в виде продуктов его спонтанного окисления. Содержание общего ГЦ в крови человека в норме не превышает 10 мкмоль/л [8]. Гипергомоцистеинемия (ГГЦ) вызывает развитие дисфункции эндотелия, активацию пролиферации гладкомышечных клеток сосудов, модификацию липопротеинов плазмы, ремоделирование экстрацеллюлярного матрикса, стимуляцию вазоконстрикции, воспаления и гиперкоагуляции [8, 9, 12]. Многими исследователями показано, что одним из эффектов ГГЦ является значительное повышение плотности сосудистой стенки из-за увеличения синтеза и накопления в ней коллагена. Опытным путем на кроликах установлено, что плотность культуры гладкомышечных клеток увеличивалась на 43 % после добавления к ней гомоцистеина. Подобный эффект объясняется способностью этой аминокислоты стимулировать синтез коллагена фибробластами сосудистой стенки, причем накопление коллагена в клеточном слое происходит параллельно с нарастанием концентрации ГЦ [8]. Последующие исследования продемонстрировали, что именно свободная тиоловая группа ГЦ играет главную роль в этом процессе [10]. Таким образом, в результате накопления коллагена и пролиферации гладкомышечных клеток сосудистой стенки происходит ее деформация, утолщение и повышение ригидности. Влияние же ГЦ на функционирование фибробластов изучено недостаточно.

Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей функционирования фибробластов в культуре клеток под действием различных концентраций гомоцистеина.

Материалы и методы

Исследование проводили на культуре фибробластов человека линии М-22. Клетки выращивали в среде DMEM с добавлением 20 % телячьей сыворотки, 20 мкг/мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES. Для исследования использовали культуру 4–6 пассажа с исходной концентрацией 20000 клеток на 1 см3. Затем засевали 96-луночные плоскодонные планшеты для культивирования клетками, предварительно ресуспендированными путем трипсинизации, в количестве 20 тысяч фибробластов на лунку в 100 мкл среды, прибавляли по 50 мкл раствора ГЦ, разведенного в среде, в дозах от 3,5 мкг/мл до 100 мг/мл и культивировали в течение суток в СО2-инкубаторе «Sanyo» (Япония) при 37 °С, 5 % СО2 и 95 % влажности. Каждую дозу ГЦ и контрольную среду вносили не менее чем в 8 лунок (1 вертикальный ряд). Затем клетки фотографировали при увеличении ´1500. Пробы культуральной среды из каждой лунки разливали в микропробирки и замораживали при -40 °С для последующих исследований. Фибробласты фиксировали 1 % глутаровым альдегидом 30 мин, промывали раствором Хенкса и окрашивали кристаллическим фиолетовым. После отмывания и высушивания добавляли в каждую лунку по 100 мкл 50 % этанола для элюции красителя из клеток. Оценку интенсивности окрашивания лунок проводили через 15–20 мин на фотометре «DigiScan 400» (Австрия) при длине волны 620 нм. Для того, чтобы исключить какое-либо влияние гомоцистеина на способность клеток к прилипанию, гомоцистеин добавляли к культурам клеток через 4 часа инкубации.

Интенсивность перекисного окисления липидов определяли по накоплению малонового диальдегида (МДА) по методу Л.И. Андреевой и др. (1988).

Уровни интерлейкинов (IL) и белков теплового шока (HSP) определяли в среде роста иммуноферментным методом с использованием диагностических наборов производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирская область).

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы «Statistica 6.1» («StatSoft»). Описательная статистика представлена медианой и межквартильным интервалом (25-го; 75-го перцентилей); сравнение зависимых выборок проводили с помощью критерия Вилкоксона; сравнение независимых выборок проводили с помощью U-критерия Манна — Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление