Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2016, № 1
|
Оригинальные статьи
|
Номер 1'2016
|
Полиморфизм генов цитокинов С-590Т IL4 и С-597А IL10 и концентрации IL-4 и IL-10 в сыворотке крови при псориазе и псориатическом артрите
М.В. Смольникова, С.В. Смирнова, А.А. Барило, В.Б. Епанешникова
Цель исследования — изучить частоту распределения аллельных вариантов полиморфизмов генов цитокинов С-590Т IL4 и С-597А IL10, их ассоциацию с уровнем концентраций IL-4 и IL-10 в сыворотке крови при псориазе (ПС) и псориатическом артрите (ПсА) для выявления маркеров прогрессирования патологии. Материалы и методы. Для проведения молекулярно-генетического анализа были обследованы больные ПС (n=97) и практически здоровые доноры крови (группа контроля, n=94), жители г. Красноярска. В исследование включены больные и практически здоровые лица европеоидного происхождения в возрасте от 18 до 66 лет. Концентрации цитокинов (IL-4, IL-10) в сыворотке крови определяли твердофазным иммуноферментным методом.Полиморфизм генов IL4 и IL10 (С-590Т) и IL-10 (С-597А) изучен методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Результаты. Выявлены статистически значимые изменения уровней цитокинов IL-4 и IL-10 в сыворотке крови в обеих группах больных в сравнении с группой контроля: увеличение IL-4 при ПсА и снижение IL-10 при ПС. Концентрация IL-10 в сыворотке крови больных ПС, носителей генотипа С/А+A/A, достоверно ниже в сравнении с группами больных ПсА и контроля. При ПсА выявлена ассоциация генотипа С/С со снижением концентрации IL-10 в сыворотке крови в сравнении с группой контроля. Заключение. Наличие редкого аллеля А-597 IL10, ассоциированное со снижением концентрации IL-10 в сыворотке крови может служить маркером развития ПС. Маркером прогрессирования ПС с развитием ПсА может служить повышение концентрации IL-4 в сыворотке крови и носительство аллеля С-597 IL10 (OR(CI) = 0,95 (0,53-1,68)). (Цитокины и воспаление. 2016. Т. 15. № 1. С. 74–80.)
Ключевые слова: псориаз, псориатический артрит, IL-4, IL-10, полиморфизм генов.
Псориаз (ПС) и псориатический артрит (ПсА) являются иммунозависимыми заболеваниями, развитие которых определяется результатом сложного комбинированного взаимодействия иммуногенетических факторов и факторов окружающей среды [8]. ПС и ПсА рассматриваются как Th17/Th1-зависимые аутоиммунные заболевания [10]. Активация Т-лимфоцитов в пораженной коже при ПС и синовиальной жидкости при ПсА сопровождается выбросом различных цитокинов, хемокинов и факторов роста, приводящих к гиперпролиферации и нарушению дифференцировки кератиноцитов эпидермиса и синовиальной оболочки [8]. Таким образом, Т-лимфоциты и дисбаланс продуцируемых ими провоспалительных и противоспалительных цитокинов играют основную роль в инициации и поддержании воспалительного процесса при ПС и ПсА [10].
В формировании псориатических повреждений при ПС и ПсА принимают участие интерлейкин 4 (IL-4) и интерлейкин 10 (IL-10), которые оказывают иммуносупрессивное действие, связанное с ингибированием Th1-иммунного ответа [2]. IL-4 является специфическим ростовым фактором для Т- и В-клеток, увеличивает образование антител, влияет на активацию В-клеток, блокирует продукцию провоспалительных цитокинов, активирует фибробласты кожи человека, Т-хелперы, макрофаги, кератиноциты, клетки Лангерганса в дерме [2]. Являясь важным компонентом Th2-иммунного ответа, IL-4 в патогенезе ПС и ПсА ингибирует экспрессию TNFα и IFNγ кератиноцитами. Есть данные, что повышение концентрации IL-4 приводит к развитию тяжелой формы ПС — псориатической эритродермии [14]. Противовоспалительный эффект IL-4 используется с лечебной целью. Цитокинотерапия тяжелых форм ПС с помощью IL-4 приводила к положительному эффекту, который связан с индукцией Th2-лимфоцитов и ингибированием Th1/IL-23/Th17-иммунного ответа [5]. IL-10 является полипотентным противовоспалительным и иммуносупрессивным цитокином, играющим важную роль в регуляции иммунного ответа, в том числе при ПС и ПсА [2]. Функциональная роль IL-10 заключается в угнетении, преимущественно Th1-иммунного ответа, что происходит в результате ингибирования антигенпрезентирующих функций макрофагов [2]. С дисбалансом продукции IL-10 связано развитие иммунопатологических заболеваний, в частности, ПС и ПсА [2].
В патогенезе ПС IL-10 играет протективную роль, дефицит IL-10 имеет ключевое значение в прогрессировании заболевания и определяет особенности его клинического течения [12]. При ПС и ПсА отмечается снижение уровня противовоспалительного IL-10, что обусловливает преобладание эффектов провоспалительных цитокинов Тh1-профиля. IL-10 оказывает супрессивное действие на макрофаги и цитотоксические лимфоциты, что приводит к торможению гиперпролиферации кератиноцитов и клеток синовиальной оболочки. Существует мнение, что дефицит IL-10 при ПС и ПсА способствует запуску ауторегулируемого процесса поляризации Th0-клеток в сторону Th2-лимфоцитов, что включает аутоиммунные механизмы формирования воспалительных процессов в коже и суставах [5, 12].
В литературе представлены разноречивые данные относительно уровней IL-4 и IL-10 в сыворотке крови при ПС и ПсА. В одних исследованиях выявлена ассоциация повышенных уровней IL-4 и IL-10 в сыворотке крови c развитием ПС [6]. В других — у больных ПС отмечено снижение концентраций IL-4 и IL-10 в сыворотке крови [14]. Есть сведения, что уровни IL-4 и IL-10 в сыворотке крови у больных ПС и здоровых людей не имели достоверных различий [15]. Несмотря на то, что IL-4 и IL-10 являются одними из основных цитокинов, вовлеченных в патогенез псориатической болезни, работ по изучению их ассоциации с ПсА немного. Есть данные о повышенном уровне IL-4 в сыворотке крови у больных ПсА в прогрессирующую стадию заболевания [11]. При ПсА, в сравнении с группой контроля, выявлено достоверное повышение уровня IL-10 в сыворотке крови, однако уровень цитокина не коррелировал с тяжестью кожных и суставных повреждений [7].
Продукция цитокинов является генетически детерминированной и зависит от наличия ограниченного количества конкретных генов-кандидатов. Отклонения в единичных нуклеотидах в последовательности генов-кандидатов (однонуклеотидные полиморфизмы или single-nucleotide polymorphism, SNPs) обусловливают нарушение их функции, что приводит к изменению уровня конечного продукта, возникновению патологии, либо влиянию на фенотип заболевания, определяя различия в степени тяжести, частоте обострений, чувствительности к фармакотерапии, темпах прогрессирования патологического процесса [3].
Выявлено несколько точечных полиморфизмов в промоторной области гена IL4 (С-1098T, С-590Т, С-285Т, А-81G, С-33Т). При ПС и ПсА наибольшее функциональное значение имеет полиморфизм С-590Т IL4 в связи с его влиянием на уровень продукции IL-4. Нарушение регуляции продукции IL-4 приводит к девиации иммунного ответа в сторону Тh1-профиля и скоплению Т-клеток, продуцирующих IL-17 в псориатических высыпаниях и клетках синовиальной оболочки. Известны следующие полиморфные участки промоторного региона гена IL10 (T-798C, С-627А, G-1082А, С-819Т, С-597А, С-571А), кодирующие уровень концентрации IL-10 в сыворотке крови. Наибольшее функциональное значение при ПС и ПсА имеют полиморфизмы G-1082А, С-819Т, С-597А гена IL10, для которых доказана ассоциация с развитием псориатической болезни [4, 5].
Таким, образом, наиболее перспективным в патогенетике ПС представляется изучение однонуклеотидных полиморфизмов промоторных регионов генов IL4 и IL10, так как эти цитокины являются одними из ключевых регуляторов иммунного ответа, определяющимиформирование иммунореактивности того или иного типа. Это позволит прогнозировать прогрессирование ПС с формированием его тяжелых форм, в частности, ПсА.
Цель исследования — изучить частоту распределения аллельных вариантов полиморфизмов генов цитокинов С-590Т IL4 и С-597А IL10, их ассоциацию с концентрациями IL-4 и IL-10 в сыворотке крови при ПС и ПсА, с целью выявления маркеров прогрессирования патологии.
Материалы и методы
Для проведения молекулярно-генетического анализа были обследованы больные ПС (n=97) и практически здоровые доноры крови (группа контроля, n=94), жители г. Красноярска. В исследование включены больные и практически здоровые европеоиды в трех поколениях в возрасте от 18 до 66 лет. На основании гендерных особенностей все исследуемые были разделены на группы: А – мужчины, больные ПС (n=56), B – мужчины группы контроля (n=50), С – женщины, больные ПС (n=41), D – женщины группы контроля (n=44). В структуре патологии выделено 2 группы: 1-я группа — ПС с изолированным поражением кожи (n=49), 2-я группа — ПсА (n=48). Исследование одобрено этическим комитетом НИИ МПС. Получены информированные согласия на участие в исследовании.
Концентрации цитокинов IL-4 и IL-10 в сыворотке крови определяли твердофазным иммуноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Выделение ДНК проводили при помощи стандартного набора реактивов для выделения ДНК из цельной венозной крови (производитель ООО «Лаборатория Медиген», г. Новосибирск). Молекулярно-генетическое определение аллельных вариантов генов IL4 и IL10 (С-590ТIL4 и С-597АIL10) осуществляли методом рестриктного анализа продуктов амплификации (ПДРФ-анализ) специфических участков генома. Амплификацию фрагмента ДНК генов IL4 и IL10 проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими участок промотора, содержащий функциональный полиморфизм в позиции С-590Т и С-597А. Амплификацию проводили с применением амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Москва). Гидролиз полученного фрагмента ДНК осуществляли с помощью специфической эндонуклеазы (рестриктазы): для С-590Т IL4 рестриктазы Bme 18I, для С-597А IL10 – Rsa I (НПО «Сибэнзим», г. Новосибирск). Рестрикционная смесь в случае определения полиморфизма генов IL4 и IL10 включала 15 мкл амплификата, 1,5 мкл 10-кратного буфера для рестрикции, поставляемого фирмой-производителем, и 2 единицы активности фермента (в зависимости от эффективности его работы). Идентификацию генотипа проводили с помощью электрофоретического разделения продуктов рестрикции в 2 % агарозном геле с окрашиванием этидием бромидом.
Расчет показателей осуществляли с использованием программы «Statistica 6.0». Для характеристики вариации вычисляли медиану (Мe) и интерквартильный размах в виде 25-го и 75-го процентилей (25%; 75%). Статистически значимыми считали различия при р<0,05.
При статистическом анализе результатов генетических исследований использовали такие показатели, как частота встречаемости генов, генотипов и их комбинаций. Соответствие распределения генотипов по исследованным полиморфным локусам равновесию Харди — Вайнберга (РХВ) проверяли по точному методу Фишера. Частоту встречаемости отдельных генотипов и их комбинаций вычисляли методом прямого подсчета по формуле: f=n/N, где n — количество раз встречаемости генотипа (комбинации генотипов), N — численность обследованных. Оценку ассоциаций полиморфных вариантов генов с патологическим фенотипом проводили по отношению шансов (OR — Odds Ratio) события в одной группе к шансам этого же события в другой группе с расчетом 95 % доверительного интервала (95% Confidence Interval — 95% CI). Статистическую значимость различий качественных признаков определяли с помощью критерия χ2 с поправкой Йейтса и двустороннего точного метода Фишера.
Результаты и обсуждение
Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Начата подписка на 2016 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
