Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2016 год
1 номер 2 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2016, № 2

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2016

Новая лекарственная форма интерферона гамма для лечения патологий костной ткани

Е.Д. Даниленко, О.С. Иванова, Л.Р. Лебедев, Е.А. Волосникова, Е.И. Рябчикова, Е.В. Зонов, М.П. Богрянцева, Г.М. Левагина

Целью работы являлось получение и исследование свойств молекулярной конструкции, содержащей аналог IFNγ как противоопухолевый и антирезорбтивный агент и алендроновую кислоту в качестве векторной молекулы для адресной доставки конструкции в область костных метастазов. Электронно-микроскопическое изучение показало, что основным компонентом препарата являются наночастицы округлой формы размером 10–20 и 20–55 нм, различающиеся по связыванию с контрастирующими веществами. В результате исследования, проведенного с использованием хроматографических и электрофоретических методов, установлено, что конъюгирование IFNγ с декстраном и алендроновой кислотой и включение в состав конструкции не приводили к серьезным нарушениям структурно-конформационных свойств белка, о чем свидетельствует сохранение его молекулярной массы, способности к образованию димеров, протеолитической устойчивости. По уровню специфической противовирусной активности, определенной на культуре клеток MRC-5, цитокин в составе конструкции не отличался существенно от исходного IFNγ. Конструкция, несущая IFNγ и алендроновую кислоту, обладала более высоким сродством к гидроксилапатиту, аналогу минерального матрикса кости, чем IFNγ, что позволяет говорить о возможности накопления белка в костной ткани, что необходимо для реализации его эффектов в отношении костных метастазов. (Цитокины и воспаление. 2016. Т. 15. № 2. С. 154–160.).

Ключевые слова: интерферон гамма, алендроновая кислота, молекулярная конструкция.

Способность злокачественных новообразований к метастазированию является одной из серьезных проблем онкологической практики. Метастазы в кости скелета, прежде всего, в позвоночник, регистрируют на поздних стадиях развития рака молочной и предстательной желез, легких, почек и ряда других злокачественных новообразований [9, 12]. Рост скелетных метастазов вызывает разрушение костной ткани, переломы, развитие болевого синдрома, ухудшение качества жизни пациентов и их инвалидизацию [8].

Интерферон гамма (IFNγ) — природный цитокин, один из ключевых факторов регуляции иммунного ответа, прежде всего, его Т-клеточного звена [2]. Помимо иммуномодулирующей активности, известны противоопухолевые свойства белка, такие как способность усиливать активность цитотоксических лимфоцитов, подавлять рост опухолевых клеток, ингибировать ангиогенез [6]. С другой стороны, показано, что IFNγ принимает участие в регуляции процессов ремоделирования костной ткани, усиливает дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты, является ингибитором остеокластогенеза [10, 14]. В связи с этим понятен интерес исследователей к этому белку как потенциальному противоопухолевому средству лечения костных метастазов.

Одной из главных проблем терапии метастазов в костную ткань является способ эффективной доставки лекарственных веществ в опухоль. В настоящее время разработаны различные стратегии получения препаратов адресного действия и средств доставки лекарств, в том числе, в виде липосом, биодеградируемых полимерных каркасов, дендримеров, мицелл, гидрогелей, вирусоподобных частиц [3, 13, 15]. В ГНЦ ВБ «Вектор» был предложен дизайн оригинальной системы для депонирования и транспортировки белков, которая представляет собой молекулярную конструкцию, содержащую в центральной части дрожжевую двуспиральную РНК (дсРНК), защищенную оболочкой из конъюгата декстран-спермидин [3, 11]. Введение в ядро конструкции дсРНК, с одной стороны, позволяет решить задачу самосборки частицы, а с другой — потенцировать активность белкового компонента за счет противоопухолевой и иммуномодулирующей активности полинуклеотидного комплекса. Достоинством данной молекулярной конструкции является возможность введения в полисахаридную оболочку дополнительных факторов тропности.

В качестве одного из таких перспективных «нацеливающих» веществ для доставки лекарства в костную ткань можно рассматривать бифосфонаты (бисфосфонаты). Бифосфонаты — производные фосфоновых кислот, синтетические аналоги эндогенных пирофосфатов, участвующих в остеогенезе. Доказанным свойством бифосфонатов является быстрое и массированное накопление в кости (около 55 % от введенной дозы после однократного внутривенного введения), что связано с их способностью связываться с высокой аффинностью с кальцием минерального матрикса [7].

Целью данной работы являлось получение и исследование свойств конструкции, несущей на своей поверхности рекомбинантный IFNγ человека и аминобифосфонат — алендроновую кислоту (АЛН), — прототипа лекарственного препарата для терапии костных метастазов.

Материалы и методы

В работе использовали рекомбинантный аналог IFNγ человека Дельтаферон, отличающийся от нативного белка делецией 10 аминокислотных остатков на С-конце молекулы и заменой кластера KRKR на KGSA [5], с концентрацией белка 1,02 мг/мл и специфической активностью 2×106 МЕ/мг; препарат натриевой соли двуспиральной рибонуклеиновой кислоты, полученный из киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae по методу [1]; АЛН («TCI», Япония); декстран 40000 Да («AppliChem», США); натрия боргидрид («Sigma», США); натрия периодат («Sigma-Aldrich», США); спермидин («MP Biomedicals»); сорбенты для хроматографии (сефадекс G-25 («Pharmacia», Швеция); сефакрил S-200 («GE Healthcare», Швеция); реактивы для электрофореза (акриламид («Gerbu», Германия); агароза («Bio-Rad Laboratories Inc.», США); красители; маркеры молекулярных масс; соли, кислоты квалификации не ниже «х.ч.».

В качестве базисной при отработке методов синтеза конъюгата декстрана с аналогом рекомбинантного IFNγ человека Дельтафероном, АЛН и спермидином использовали методику, ранее разработанную для получения конъюгата декстрана с рекомбинантным фактором некроза опухоли альфа (TNFα) человека и спермидином [3]. Молекулярную конструкцию получали методом самосборки, для чего синтезированные конъюгаты смешивали с препаратом дсРНК и инкубировали при температуре (6±2) °С.

Для характеристики конъюгатов декстрана с IFNγ, АЛН и спермидином использовали метод вертикального гель-электрофореза в 15 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях с последующим окрашиванием красителем «Кумасси R-250». Способность конъюгатов к взаимодействию с дсРНК с образованием конструкций оценивали электрофорезом в 1 %-ном геле агарозы с визуализацией нуклеиновых кислот бромистым этидием.

Электронно-микроскопическое исследование образцов молекулярных конструкций проводили с помощью просвечивающего электронного микроскопа «Jem-1400» («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Анализируемый препарат разводили в 10 раз водой miliQ, сорбировали на медную сетку, покрытую формваровой пленкой с напылением углеродом, в течение 1 мин. Излишки жидкости отбирали фильтровальной бумагой, сетки контрастировали 2 %-м раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты или 0,5 %-м раствором уранилацетата в течение 10 с. Измерения объектов проводили непосредственно на мониторе цифровой камеры с помощью программы «iTEM», версия 5.2 («Olympus Soft Imaging Solutions», Германия).

Молекулярную массу IFNγ в конъюгате с декстраном и конструкции определяли методом электрофореза в 12 %-ном ПААГ в денатурирующих редуцирующих и нередуцирующих условиях, а также гель-хроматографией на колонке с Сефакрилом S200, используя белки-маркеры молекулярных масс (лизоцим — 14400 Да, яичный альбумин — 45000 Да, бычий сывороточный альбумин, БСА — 68000 Да) [4].

Для оценки устойчивости IFNγ в составе конструкции к действию трипсина в раствор исследуемого образца, содержащего белок в количестве 10 мкг, вносили свежеприготовленный раствор трипсина с активностью 26,8 е.а./г в количествах 0,3 и 1 мкг, из расчета трипсин : белок — 1:10 и 1:30 (по массе). По завершении инкубации (при 20–25 °С в течение 10 мин) добавляли «стоп-раствор» (додецилсульфат натрия, 2-меркаптоэтанол и бромфеноловый синий в 20 %-ом растворе глицерина). После прогревания (5 мин при 90 °С) продукты реакции анализировали электрофорезом в 12 %-м ПААГ.

Связывание конъюгатов и конструкций, содержащих IFNγ и АЛН,с гидроксилапатитом (ГАП) оценивали методом хроматографии, как описано в[4]. Десорбцию проводили линейным градиентом хлорида натрия от 0,1 до 1,5 М. Для анализа хроматографических фракций использовали метод электрофореза в 15 %-м ПААГ.

Определение специфической активности IFNγ в составе конъюгатаи конструкции проводили микрометодом в культуре диплоидных клеток MRC-5 по подавлению цитопатического действия тест-вируса энцефаломиелокардита, штамм Колумбия, в дозе 100 ЦПД50 относительно референс-препарата Interferon-g Human Recombinant expressed in E. coli, Саt. №13265, «Sigma».

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2017 Цитокины и Воспаление