Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2018 год
1-4 номера

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2017, № 4

Подписаться на 2019 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Краткие сообщения

Номер 4'2017

Слитый рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI Pseudomonas aeruginosa: получение и исследование иммунобиологических свойств

Е.М. Зимина, А.А. Калошин, Н.А. Михайлова

При помощи генно-инженерных методов получена рекомбинантная плазмидная конструкция, кодирующая аминокислотные последовательности двух мембранных белков и делеционного варианта экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa — анатоксина. Полученной плазмидой трансформировали клетки Escherichia coli, в которых при контролируемой экспрессии генов в «тельцах включения» накапливался слитый рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI. Очищенный рекомбинантный белок обладал выраженными иммунобиологическими свойствами, оказывая протекцию иммунизированных мышей от инфекции, вызываемой живой вирулентной культурой Pseudomonas aeruginosa штамма РА103, и стимулируя выработку специфических антител. (Цитокины и воспаление. 2017. Т. 16. № 4. С. 66–69).

Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, слитый рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI, экзотоксин А, белок F наружной мембраны, белок I наружной мембраны.

Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa), обладая многочисленными факторами патогенности, является возбудителем целого ряда инфекций различной степени тяжести и локализации. Ввиду устойчивости микроорганизма к широкому спектру антибиотиков, традиционное лечение синегнойной инфекции малоэффективно. Поэтому в России и за рубежом создаются специфические иммунобиологические препараты и, в частности, профилактические вакцины на основе протективных антигенов возбудителя, полученных генно-инженерными методами.

В патогенезе синегнойной инфекции наиболее важную роль играют высококонсервативные белки F (OprF) и I (OprI) наружной мембраны и секретируемый экзотоксин А [4, 11]. Первый белок является порообразующим, отвечает за транспортную функцию, белок OprI является структурными липопротеином. Механизм действия экзотоксина А сводится к нарушению синтеза белка, приводящему к гибели клетки [5, 8–10].

Ранее в ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» были получены и исследованы иммуногенные свойства рекомбинантных белков OprF, OprI, делеционного варианта экзотоксина А (aTox), а также слитого рекомбинантного белка OprF-aTox [1–3, 7].

Для увеличения спектра специфической активности представляется целесообразным получение слитого рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности обоих мембранных белков и экзотоксина А.

Целью настоящего исследования стало получение слитого рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI P. aeruginosa и исследование его иммунобиологических свойств.

Материалы и методы

В качестве основы для создания новой рекомбинантной конструкции служила плазмидная конструкция pET-28b-OprF-aTox, полученная ранее в ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» [7]. Нуклеотидную последовательность, кодирующую ген oprI, получали с помощью ПЦР с использованием ДНК-матрицы, представляющей собой плазмиду для экспрессии гена oprI [1]. Реакцию лигирования проводили в течение 12 ч при температуре 12 ºС, после предварительной обработки плазмидной ДНК и амплифицированного гена рестриктазой Xho I. Клоны отбирали рестриктным анализом (используя рестриктазы Xho I и Hind III, реакцию проводили при температуре 37 ºС в течение 1 ч) и секвенированием в приборе «ABI Prism 3100 Genetic Analyzer» согласно инструкции производителя («Applied Biosystems», США). Трансформацию клеток E. coli проводили методом «теплового шока». Культуру E. coli выращивали на агаризованной и жидкой средах LB с добавлением антибионика канамицина в течение 16–18 ч при температуре 37 ºС. Экспрессию осуществляли с добавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) («Thermo Scientific», США). Очистку рекомбинантного белка проводили с использованием хроматографической системы Biologic LP («BIO-RAD Laboratories, Inc.», США) на Ni-сефарозе. Для анализа белковых продуктов по методу Лэммли использовали 12 % полиакриламидный гель (ПААГ) [6].

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2019 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2019 Цитокины и Воспаление