Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2018 год
1-4 номера

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2017, № 4

Подписаться на 2019 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 4'2017

Клеточный иммунитет и экспрессия гена PON-1 при сепсисе и раке молочной железы в мышиных моделях

Е.В. Моисеева, Д.А. Аронов, С.Г. Семушина, Б.В. Яненко, Н.В. Антипова, М.И. Шахпоронов

Тяжелый сепсис характеризуется снижением активности сывороточного фермента параоксаназы‑1 (PON1) и множеством иммунологических нарушений. Сепсис является одним из наиболее тяжелых осложнений у пациентов с раком молочной железы (РМЖ) и сопряжен с высокой летальностью. Для успешного раннего выявления признаков сепсиса необходим поиск иммунологических и молекулярных биомаркеров. Целью работы было сравнение изменения иммунологических показателей крови и уровня экспрессии гена PON1 в мышиных моделях сепсиса и РМЖ. Материалы и методы. В мышиных моделях естественно развивающегося тяжелого сепсиса и поздней стадии РМЖ измеряли иммунологические показатели крови методом проточной цитометрии; уровень экспрессии гена PON1 в клетках перитонеальной жидкости — методом RTQ-PCR. В каждой модели данные экспериментальных групп сравнивали с интактным контролем. Результаты. У опухоленосителей на поздних стадиях роста перевитого РМЖ был выявлен спектр нарушений, характерный для сепсиса: снижение уровней лимфоцитов и эозинофилов при повышении уровнкй нейтрофилов и активированных хелперов в крови, а также снижение уровня экспрессии гена PON1 по сравнению с контролем. Заключение. В обеих используемых мышиных моделях воспроизводились закономерности изменения молекулярного и иммунологических биомаркеров, продемонстрированные для человека, что открывает перспективы дальнейшего изучения прогностического значения выявленных и подтвержденных биомаркеров на этих мышиных моделях. (Цитокины и воспаление. 2017. Т. 16. № 4. С. 53–57.)

Ключевые слова: сепсис, воспаление, рак молочной железы, ген PON1.

Среди онкологических заболеваний женщин рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в мире по заболеваемости и второе — по смертности. Позднее обращение пациенток к врачу и ошибки диагностики приводят к тому, что в ряде стран в связи с отсутствием программ регулярного скрининга у значительного количества больных раком молочной железы до сих пор заболевание диагностируется на поздних стадиях и зачастую протекает с распадом опухоли [15]. При этом продукты распада тканей вызывают синдром системного воспалительного ответа, клинически сходный с сепсисом [9]. Опасность развития собственно сепсиса также угрожает жизни раковых пациентов в силу целого ряда обстоятельств, а именно: высокая вероятность внутрибольничных инфекций вследствие частого пребывания в клинике, хирургические процедуры, прогрессивное ослабление иммунитета по мере роста опухоли и др. [5]. При этом не следует забывать, что РМЖ настолько гетерогенен, что предсказание судьбы пациента даже на продвинутых стадиях заболевания чрезвычайно затруднено [12].

Клиническое значение сепсиса определяется его широкой распространенностью и высокой летальностью. Несмотря на значительные достижения в развитии медицины, существенного снижения смертности от септического шока не удается достичь даже в развитых странах. Вероятно, это связано с недостаточным пониманием механизмов иммунологических нарушений, возникающих при синдроме системного воспалительного ответа и сепсиса [9]. Известно, что оксидативный стресс является основным промотором и активатором системного воспалительного процесса. При этом сывороточный фермент параоксаназа-1 (PON1) защищает организм от окислительного стресса, но и одновременно подвергается инактивации [6]. Примечательно, что данные по уровню экспрессии гена параоксаназы-1 (PON1) в литературе отсутствуют, тогда как прогностическая роль активности фермента PON1 как суррогатного биомаркера сепсиса уже выявлена и в эксперименте, и в хирургической клинике [6]. В литературе также имеются указания на прогностическое значение активности сывороточного фермента PON1 при РМЖ как маркера непродолжительного безрецидивного периода после хирургии при РМЖ [4].

Для разработки методов предсказания судьбы пациента с РМЖ следует использовать адекватные мышиные модели и вести целенаправленный поиск суррогатных маркеров [1, 2]. Ранее нами было показано, что по целому ряду гематологических, биохимических и иммунологических параметров крови мыши можно предсказать скорость роста перевиваемой опухоли, исход реципиента с РМЖ после применения локальной иммунотерапии и время проявления спонтанного РМЖ у самок высокораковой линии [1, 2]. Мы предположили, что среди иммунологических параметров крови в наших моделях можно выявить биомаркеры как при собственно сепсисе, так и при синдроме системного воспалительного ответа, характерном для РМЖ. Также снижение активности PON1 в сыворотке раковых больных и пациентов с сепсисом может быть связано со снижением активности гена PON1.

Цель настоящей работы — сравнение иммунологических параметров крови и уровня экспрессии гена PON1 в мышиных моделях тяжелого сепсиса и на поздних стадиях роста перевитого РМЖ с соответствующими показателями интактных мышей.

Материалы и методы

Мышей авторской линии CBRB-Rb(8.17)1Iem (CBRB) с высокой частотой естественно проявляющихся (спонтанных) опухолей молочной железы (ОМЖ) и стандартных низкораковых линий BALB/cJCitMoise (B/c) и A/WySnJCitMoise (A/Sn) из коллекции Е.В. Моисеевой содержали в конвенциональных условиях вивария ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН. Каждой мыши на момент регистрации в племенном журнале присваивали индивидуальную метку и наблюдали в течение жизни как ветеринарного пациента. Все исследования in vivo с использованием лабораторных животных были одобрены Институтской комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных.

Ранее мы показали, что непатогенная и условно-патогенная микрофлора окружающей среды, не вызывающая заболевания у молодых мышей CBRB, осложняет течение атопического дерматита у стареющих особей, приводя к возникновению ряда хронических инфекционно-воспалительных процессов в коже и внутренних органах, что, в свою очередь, приводит к развитию сепсиса у некоторых стареющих мышей [3]. В исследование были включены самки мышей CBRB на конечной стадии естественно развивающегося тяжелого сепсиса (критерии: снижение веса, отказ от пищи, гипотермия) и контрольные самки того же возраста без симптомов сепсиса. Данные по возрасту и количеству мышей в группах представлены в таблице. У всех животных были взяты образцы крови из венозного ретроорбитального синуса в объеме 300±10 мкл. Затем мышей подвергли эвтаназии методом цервикальной дислокации и получили образцы перитонеальной жидкости (ПЖ). Для проведения цитометрического анализа эритроциты в образцах крови лизировали в растворе хлористого аммония (150 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3, 0,1 мМ Na2EDTA) в течение трех минут, затем пробы осаждали, к осадку добавляли 100 мкл буфера для проточной цитометрии (1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% азида натрия в PBS) и инкубировали в течение 30 минут при температуре 4 оС с моноклональными антителами («Biolegend», США): CD4 (FITC), CD8 (FITC), CD3 (FITC), F4/80 (FITC), CD25 (PE), NK1.1 (PE), CD19 (PE), CD11b (PE), CD45 (PerCP). На проточном цитометре «FACScan» («BD», США) измеряли уровень 12 клеточных показателей иммунной системы крови: лимфоцитов (CD45highSSClow), моноцитов (F4/80+SSCint), нейтрофилов (CD11b+F4/80negSSCint), эозинофилов (F4/80+SSChigh), Т-лимфоцитов (CD3+), CD4+ Т-хелперов, CD8+цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), CD19+ B-лимфоцитов, CD49b+ NK-лимфоцитов, CD49b+CD3+ NK-T лимфоцитов, CD4+CD25+ активированных (акт.) Т-хелперов, CD8+CD25+ акт. ЦТЛ. Анализ полученных данных проводили в программе «Flowing Software 2.5.1» («Turku Centre for Biotechnology», Финляндия). Для молекулярно-генетического исследования использовали индивидуальные образцы клеток ПЖ, которые помещали в 500 мкл раствора реагента для выделения суммарной РНК ExtractRNA (ЗАО «Евроген», Россия). Затем проводили процесс выделения мРНК (по протоколу Matz, 2002). Качество РНК проверяли электрофорезом в 1%-м агарозном геле в присутствии бромида этидия. Количество РНК определяли по поглощению при длине волны 260 нм на спектрофотометре («Thermo Scientific NanoDrop 2000», США). Для получения кДНК отбирали 1 мкг тотальной РНК с использованием набора «MMLV RT kit» (ЗАО «Евроген», Россия) по протоколу производителя. Уровень экспрессии гена PON1 определяли методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (RTQ-PCR) с помощью амплификатора «LightCycler® 96 Real-Time PCR System» («Roche», Швейцария) с использованием праймеров, специфичных для PON1 (Прямой праймер: GCT GAA GAC TTA GAG ATT CT; обратный праймер: ATC TGT GAA TGT ACT AAT CCC). Интеркалирующий краситель SYBR Green I (ЗАО «Евроген», Россия) использовали в качестве флуоресцентного индикатора двухцепочечной ДНК. Нормирование образцов кДНК проводили по контрольному гену АСТВ, кодирующему актин. Затем проводили анализ экспрессии гена PON1 в образцах. Полученные данные анализировали индивидуально и представляли в виде уровня экспрессии гена PON1 относительно гена ACTB в данном образце.

Самки колоний CBRB, A/Sn и B/c демонстрировали 50%, <5% и <1% спонтанных ОМЖ, соответственно. Опухолевые линии CB-MC, A-MC и BC-MC были получены из спонтанных ОМЖ, патоморфологически охарактеризованы и поддерживались путем пассажей in vivo. В исследование были включены сингенные реципиенты линий CBRB, A/Sn и B/c, только самки или только самцы использовались в каждом эксперименте (данные по полу и возрасту на момент перевивки опухоли представлены в таблице). Интактных мышей того же возраста использовали в качестве контроля. В качестве основного критерия критического состояния мышей, определяющего необходимость немедленной эвтаназии, использовали отказ от пищи независимо от размера опухоли [1]. На поздней стадии роста перевитой опухоли у всех опухоленосителей, а также у контрольных мышей были взяты образцы крови из ретроорбитального синуса в объеме 300±10 мкл для проведения цитометрического анализа. Затем животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации и получали образцы ПЖ. Цитометрический и молекулярно-генетический анализы проводили как описано выше. Данные по экспрессии гена PON1 в моделях РМЖ представляли как долю мышей-опухоленосителей с пониженной экспрессией гена PON1 по сравнению с медианой уровня экспрессии гена PON1 в группе интактного контроля. Статистическую значимость различий оценивали в программе «Statistica12» («StatSoft», США) по U-критерию Манна — Уитни.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2019 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2019 Цитокины и Воспаление