Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2018 год
1-4 номера

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2018, №№ 1-4

Подписаться на 2019 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1-4'2018

Моноклональные антитела к С-концевому фрагменту рекомбинантного антимюллерова гормона человека: инструмент для очистки, детекции и исследования

А.Я. Рак, А.В. Трофимов, А.А. Колобов, А.М. Ищенко

Работа посвящена получению и характеристике свойств панели моноклональных мышиных антител против С-концевого фрагмента рекомбинантного антимюллерова гормона (рАМГ) человека. Показано, что они специфичны по отношению к трем независимым эпитопным областям молекулы гормона, а антитела ACMIS-3 также обладают способностью блокировать его взаимодействие с рецептором. Полученные антитела могут быть использованы как для выделения препаративных количеств высокоочищенного С-концевого фрагмента рАМГ (С-рАМГ), так и для создания диагностических тест-систем, позволяющих исследовать новые биохимические характеристики гормона и производить его детекцию в биологических жидкостях. (Цитокины и воспаление. 2018. Т. 17. № 1–4. С. 72–79.)

Ключевые слова: антимюллеров гормон, антитела, гибридома, рекомбинантный белок.

Антимюллеров гормон (АМГ) является одним из наименее изученных членов суперсемейства цитокинов трансформирующего фактора роста β (TGFβ). В эмбриогенезе млекопитающих этот фактор направляет развитие репродуктивной системы по мужскому типу, а в постнатальном периоде жизни — участвует в регуляции баланса половых гормонов [1]. Большую клиническую значимость имеет определение сывороточного уровня АМГ, позволяющее судить о величине овариального резерва, характере течения беременности у женщин и наличии нормально функционирующей тестикулярной ткани в организме у мужчин [7, 9, 13]. Кроме того, показано, что рекомбинантный АМГ (рАМГ) обладает противоопухолевой активностью в отношении клеток, имеющих на своей поверхности специфические рецепторы АМГ II типа (MISRII), индуцируя в них апоптоз [12].

Молекула гликопротеина АМГ имеет массу около 140 кДа и является гомодимером. Показано, что АМГ in vivo подвергается расщеплению на два главных фрагмента, которые представляют собой N- и С- концевые гомодимеры с молекулярными массами 115 и 25 кДа, соответственно [1 ,4, 6]. Сайт специфического протеолиза в каждой полипептидной цепи полноразмерного гомодимера локализован между аминокислотными остатками Arg427 и Ser428 [11]. После такого расщепления молекула АМГ переходит в активное состояние. При этом С-концевой фрагмент АМГ (С-АМГ), действуя как индивидуальная молекула или в нековалентном комплексе с N-концевым фрагментом, связывается с рецептором АМГ II типа — MISRII — и передает активирующий сигнал внутрь клетки [6].

Учитывая возможные молекулярные трансформации молекулы АМГ in vivo и in vitro, а также диагностическую важность определения сывороточного уровня АМГ для оценки репродуктивного потенциала человека, представляется важным разрабатывать новые инструменты для детекции производных АМГ, циркулирующих в крови пациентов.

Кроме того, ввиду возможности использования рАМГ в качестве противоопухолевого лекарственного агента, также является весьма актуальной разработка иммунохимических средств оценки качества получаемых препаратов рАМГ [12].

Дифференциальная детекция производных АМГ и рАМГ in vivo и in vitro может быть достигнута путем получения панели моноклональных антител, распознающих различные фрагменты молекулы АМГ и разработки на их основе новых тест-систем. Кроме того, разнообразные моноклональные антитела могут быть использованы для синтеза иммуносорбентов, пригодных для выделения индивидуальных компонентов из сложной смеси молекулярных производных АМГ, а также для изучения их свойств.

В настоящей работе был получен ряд гибридом, продуцирующих мышиные моноклональные антитела к различным эпитопам С-концевого фрагмента рАМГ (С-рАМГ) человека, и исследованы свойства данных антител.

Материалы и методы

В экспериментах были использованы полученные по ранее разработанным методикам высокоочищенные препараты С-рАМГ и химерного белка MISRII+Fc, состоящего из внеклеточной части MISRII и Fc-фрагмента иммуноглобулина IgG1 человека [3]. Препарат, содержащий цельный рАМГ и фрагментированный по одной цепи гормон, получали из культуральной жидкости клеток линии СНО (ATCC, США), трансфецированных геном АМГ человека (штамм CHO-MIS#26), по ранее описанной методике [8].

Для получения моноклональных антител использовали самцов мышей линии Balb/c. Иммунизацию животных проводили очищенным С-рАМГ, с интервалом в 30 дней в подошвенный апоневроз задних конечностей из расчета 50 мкг эмульгированного белка (С-рАМГ человека) на мышь. Гибридомы получали по методу Мильштейна — Келера, для чего лимфоциты животных, взятые на 4-е сутки после повторной иммунизации, смешивали с клетками миеломы мыши линии Sp2/0 (из расчета 50000 клеток на лунку 96-ячеечного планшета) в соотношении 2:1 в присутствии полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 Да. Культивирование клеток после слияния проводили в селективной среде НАТ («Sigma», США) в планшетах с суточными перитонеальными макрофагами мыши. Первичный скрининг клонов проводили спустя 10 дней, используя прямой твердофазный ИФА. При этом антиген (С-рАМГ) иммобилизовали в лунках планшета сорбцией из раствора с концентрацией 1,5 мкг/мл в 20 мМ боратном буфере рН 8,0 в течение 20 ч при комнатной температуре, затем добавляли культуральную жидкость, содержащую исследуемые антитела, а через 1 час вносили раствор (1:4000) вторых антител — пероксидазного конъюгата антител козы против Fc-фрагмента мышиных иммуноглобулинов класса IgG («Sigma», США). Изотипирование моноклональных антител проводили с использованием набора «Rapid ELISA Mouse Isotyping Kit» («Thermo Scientific», США) по протоколу, предложенному производителем.

Клетки клонов, отобранных по итогам первичного скрининга и получивших наименования ACMIS-1, ACMIS-3, ACMIS-4, ACMIS-5, ACMIS-6 и М1, повторно клонировали для проверки стабильности секреции антител, затем культивировали во флаконах площадью 125 см2 для криоконсервации. Для наработки антител клетки каждого клона гибридом внутрибрюшинно вводили мышам из расчета по 2 млн клеток на мышь. Выделение антител производили из асцитных жидкостей мышей, собранных спустя 10 суток после введения с помощью метода аффинной хроматографии на белке А с использованием сорбента «MabSelect» («GE», США) по стандартному протоколу. В качестве контрольных антител в анализах были использованы нормальные иммуноглобулины класса IgG мыши («Sigma», США).

Для определения эпитопной специфичности полученных антител использовали полученные методом твердофазного синтеза по ранее предложенному протоколу биотинилированные пептиды с аминокислотными последовательностями SAGATA-(СН2)10-биотин, RSAGATA-(СН2)10-биотин и AGATA-(СН2)10-биотин [5].

Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле осуществляли по ранее описанной методике [14]. В работе использовался разделяющий гель с градиентной концентрацией акриламида 4–20 % и концентрирующий гель с концентрацией акриламида 5 %. Результаты электрофореза визуализировали с помощью стандартного окрашивания раствором Кумасси G-250. В ряде случаев анализ результатов электрофоретического разделения проводили с помощью вестерн-блота по стандартному протоколу [10]. Для переноса белков использовали буферный раствор, содержащий 47,9 мМ Трис-HCl, 38,6 мМ глицина и 20 % метанола, и нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм. Перенос проводили в течение 1 ч при силе тока 350 мА, после чего мембрану инкубировали в блокирующем растворе (2 % BSA в 20 мМ фосфатном буферном растворе, рН 7,4 (ФБ)) в течение ночи при +4 °С. Затем вносили раствор первичных антител (5 мкг/мл) в блокирующем растворе (для негативного контроля использовали нормальные иммуноглобулины мыши. После часовой инкубации и двукратной отмывки мембрану также в течение часа обрабатывали раствором антивидового пероксидазного конъюгата антител козы против иммуноглобулинов класса IgG мыши («Sigma», США) с концентрацией 0,5 мкг/мл. Для проявления окрашивания использовали 0,05 % раствор диаминобензидина (ДАБ) («Sigma», США) в ФБ, содержащем 1 % диметилсульфоксида («Sigma», США) и 1 % перекиси водорода (ООО «НеваРеактив», Россия).

При проведении иммуноферментного анализа (ИФА) захватывающие антитела или антиген сорбировали в лунках планшета в концентрации 1,5 мкг/мл в 20 мМ боратном буфере (рН 8,0) в течение ночи при комнатной температуре. На следующем этапе анализа после трехкратной отмывки в лунки вносили антиген или специфичные к нему антитела, инкубацию с которыми проводили в течение часа при +37 °С. Затем в промытые лунки вносили раствор пероксидазного конъюгата антител, специфичных к предыдущему компоненту ИФА, в концентрации 0,5 мкг/мл, и также проводили инкубацию в течение часа при +37 °С. Регистрацию иммуноферментной реакции производили при длине волны 450 нм стандартным методом с использованием тетраметилбензидина и ридера для микроплат «BioRad Reader Model 680» («BioRad Laboratories, Inc.», США).

Выделение препаратов рАМГ из культуральной жидкости клеток-продуцентов осуществляли методом иммуноаффинной хроматографии. Иммуносорбенты получали путем иммобилизации полученных моноклональных антител на цианбром-активированной сефарозе FF («GE», Швеция). Колонку, уравновешенную ФБ, после нанесения культуральной жидкости, свободной от клеток-продуцентов, промывали пятью объемами уравновешивающего буфера. Далее для удаления неспецифически связавшихся белков пропускали один объем ФБ, содержащего 1 М NaCl, после чего вновь уравновешивали колонку ФБ и проводили элюцию раствором 0,1 М глицина, рН 2,5, при скорости потока 1 мл/мин. В ходе хроматографии пики детектировали при длине волны 280 нм.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2019 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2019 Цитокины и Воспаление