Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2018 год
1-4 номера

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2018, №№ 1-4

Подписаться на 2019 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1-4'2018

Кальций-фосфатные бионы индуцируют секрецию провоспалительных цитокинов интерлейкина 6 и интерлейкина 8 артериальными эндотелиальными клетками in vitro

Д.К. Шишкова, М.Ю. Синицкий, Е.А. Великанова, А.Г. Кутихин

Цель исследования: оценка профиля секреции провоспалительных цитокинов артериальными эндотелиальными клетками человека под воздействием кальций-фосфатных бионов, образующихся в крови человека при перенасыщении ионами кальция и фосфора. Материалы и методы: к конфлюэнтным культурам эндотелиальных клеток коронарной и внутренней грудной артерии человека в 6-луночных планшетах были добавлены магний-фосфатные и кальций-фосфатные бионы в равных концентрациях (100 мкл, ОП650 = 0,08–0,10). После 24 ч культивирования забирали культуральную жидкость с последующим измерением в ней уровней провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-23, TNFα, IFNγ) посредством иммуноферментного анализа. Кроме того, из клеточной массы выделяли РНК с последующей обратной транскрипцией для синтеза кДНК и оценкой экспрессии генов, кодирующих вышеуказанные цитокины (IL1B, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL23, TNF, IFNG), методом количественной полимеразной цепной реакции. Результаты: воздействие кальций-фосфатных бионов приводило к статистически значимому повышению экспрессии генов IL1B, IL6, IL8, IL12A и IL23 в сочетании с увеличением секреции IL-6 и IL-8 эндотелиальными клетками как коронарной, так и внутренней грудной артерии человека. Воздействие магний-фосфатных бионов не оказывало подобного действия. Заключение: кальций-фосфатные бионы специфично повышают как экспрессию генов IL6 и IL8, так и выделение соответствующих цитокинов культурами артериальных эндотелиальных клеток. В то же время в отношении некоторых изученных цитокинов уровень генной экспрессии не коррелировал с их секрецией эндотелиальными клетками. (Цитокины и воспаление. 2018. Т. 17. № 1–4. С. 80–85.)

Ключевые слова: бионы, эндотелиальные клетки, цитокины, интерлейкин-6, интерлейкин-8.

Повышение уровней ионов кальция и фосфора, а также снижение уровней антикальцифицирующих белков фетуина-А и альбумина в крови ассоциировано с атеросклерозом и его клиническими проявлениями — ишемической болезнью сердца, острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу и заболеванием периферических артерий [3, 13]. Одним из физиологических механизмов поддержания минерального гомеостаза крови является образование кальций-фосфатных бионов (КФБ), которые представляют собой кристаллические частицы губчатой структуры сферической или игольчатой формы диаметром ≤ 500 нм, состоящие из гидроксиапатита, карбонат-гидроксиапатита и ряда белков, включая ключевые ингибиторы кальцификации — альбумин и фетуин-А [6, 15]. Экспериментально доказано, что КФБ выделяются из 75 % атеросклеротических бляшек крупных артерий человека и после своего формирования интернализируются эндотелиальными клетками, запуская процесс апоптоза по внутреннему пути и вызывая развитие гипертрофии интимы брюшной аорты крыс [6]. Исходя из этого, нами была выдвинута гипотеза о триггерной роли КФБ в развитии атеросклероза посредством повреждения эндотелия, поскольку нарушение целостности эндотелия является ключевым инициирующим фактором патогенеза атеросклероза [4, 6].

Вместе с тем остается открытым вопрос о специфичности эндотелиотоксического действия КФБ, поскольку неизвестно, чем именно определяется токсическое действие КФБ — специфическим химическим составом (гидроксиапатитом и карбонат-гидроксиапатитом) или же корпускулярной природой, общей для всех типов бионов. Данный вопрос актуален как для патофизиологии атеросклероза, так и для нанотоксикологии в связи с активно разрабатываемыми наноразмерными средствами направленной доставки лекарственных препаратов, которые обычно вводятся перфузионно [2]. Для ответа на данный вопрос были искусственно синтезированы магний-фосфатные бионы (МФБ), которые обладают схожими с КФБ физическими (форма, размерность, степень кристалличности) и химическими (элементный состав, функциональные группы, органический состав) параметрами, однако состоят не из характерного для КФБ гидроксиапатита, а из магния фосфат гидрата (собственные неопубликованные данные). Таким образом, можно предположить, что МФБ подходят для оценки специфичности токсического действия КФБ в эксперименте.

Поскольку повышенная секреция эндотелиальными клетками провоспалительных цитокинов является характерной для развития атеросклероза, целью данной работы была оценка профиля секретируемых артериальными эндотелиальными клетками цитокинов, а также профиля экспрессии соответствующих генов под воздействием КФБ и МФБ [1, 11].

Материалы и методы

Искусственный синтез бионов

КФБ были синтезированы путем последовательного добавления 9,9 мкл 0,5 М раствора CaCl2 («Sigma-Aldrich») и 21,5 мкл 0,2 М раствора Na2HPO4 к 1319 мкл среды DMEM, содержащей 150 мкл (10 % от общего объема) фетальной телячьей сыворотки. МФБ были синтезированы при помощи последовательного добавления 100 мкл 0,2 М раствора MgCl2 («Sigma-Aldrich») и 100 мкл 0,2 М раствора Na2HPO4 («Sigma-Aldrich») к 700 мкл среды Игла, модифицированной по Дульбекко (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM, «Gibco»), содержащей 100 мкл (10 % от общего объема) фетальной телячьей сыворотки («Gibco»). Контроль pH осуществляли путем предварительного добавления 5 мл буфера HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота, «Gibco») к 495 мл культуральной среды DMEM (финальная концентрация HEPES-буфера в среде — 1 %).

После кратковременного перемешивания на вортексе пробирки емкостью 1,5 мл («Eppendorf») с реагентами для синтеза бионов инкубировали при температуре 37 °С («MCO-18AIC», «Sanyo») в течение 24 ч с дальнейшим центрифугированием при 200,000 g и температуре 4 °С в течение 1 ч («Optima MAX-XP», «Beckman Coulter»). С целью получения рабочего раствора для добавления к клеткам осадок КФБ растворяли в 300 мкл, а осадок МФБ — в 500 мкл однократного фосфатно-солевого буфера (ФСБ, «Gibco»), что позволяло достичь оптической плотности при 650 нм (ОП650) в 0,08–0,10 («Униплан (АИФР-01)», «Пикон»), являющейся минимально измеримой и патофизиологически релевантной величиной концентрации бионов в растворе. Все указанные процедуры проводили в стерильных условиях.

Экспозиция культур эндотелиальных клеток с бионами

Для экспериментов были использованы коммерческие культуры первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека HCAEC (human coronary artery endothelial cells) и первичных эндотелиальных клеток внутренней грудной артерии человека HITAEC (human internal thoracic artery endothelial cells) («Cell Applications»). Согласно информации поставщика, вышеуказанные линии клеток были получены из здоровых артерий доноров (HCAEC — мужчина, 27 лет; HITAEC — мужчина, 50 лет) с криоконсервацией на втором пассаже (500,000 клеток в базальной среде «MesoEndo Cell Basal Medium» («Cell Applications»), содержащей 10 % фетальной телячьей сыворотки и 10 % диметилсульфоксида (dimethyl sulfoxide (DMSO)). Для проведения эксперимента клетки размораживали и культивировали согласно рекомендациям производителя в среде для роста клеток «MesoEndo Cell Growth Medium» («Cell Applications»). Пересев производили по достижении 80 % конфлюэнтности. После четырех-пяти пассажей клетки рассевали в лунки 6-луночного планшета для проведения дальнейших экспериментов. Все эксперименты с клетками проводили в стерильных условиях при 37 °C, 5 % CO2 и высокой влажности (инкубатор «MCO-18AIC», «Sanyo»).

Токсичность бионов для культур эндотелиальных клеток человека изучали при помощи добавления суспензии КФБ или МФБ (100 мкл на лунку 6-луночного планшета, ОП650=0,08–0,10) к вышеописанным первичным культурам артериальных эндотелиальных клеток (> 90 % конфлюэнтности в 6-луночных планшетах, культивирование в течение 24 ч, 11 лунок на группу). В качестве контрольной группы использовали те же линии клеток, к которым вместо бионов в аналогичном объеме добавляли стерильный ФСБ с последующим аналогичным временем культивирования.

Измерение уровня секретируемых цитокинов

По завершении инкубации из лунок при помощи автоматического одноканального дозатора («Ленпипет») забирали культуральную жидкость, которую разделяли на аликвоты объемом 400–500 мкл по 4 пробиркам емкостью 1,5 мл («Eppendorf») и хранили при температуре -40 °С до измерения профиля секретируемых клетками провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-23, TNFα, IFNγ) посредством иммуноферментного анализа с применением соответствующих наборов реагентов компании «Abcam» (ab46052, ab46027, ab46032, ab46034, ab46143, ab64708, ab46087, ab46025) в соответствии с инструкциями производителя. Выбор указанных цитокинов был обусловлен их секрецией эндотелиальными клетками и центральной ролью в развитии атеросклероза [1, 11]. Каждую аликвоту культуральной жидкости размораживали и использовали для анализа не более одного раза. Измерение результата проводили на микропланшетном спектрофотометре «Униплан» на длине волны 450 нм.

Измерение уровня генной экспрессии

Непосредственно после окончания культивирования было проведено выделение тотальной РНК из клеточных культур (три биологических репликаты, каждая из которых содержала РНК из четырех или трех лунок, на группу). Перед началом эксперимента рабочую зону и все используемое оборудование обрабатывали 0,01 % раствором диэтилпирокарбоната (ингибитор рибонуклеаз). Выделение РНК из клеточных культур проводили с помощью коммерческих наборов «Arcturus® PicoPure® RNA Isolation Kit» («Applied Biosystems») согласно протоколу производителя. Концентрацию и качество выделенной РНК оценивали с помощью спектрофотометра «NanoDrop 2000» («Thermo Scientific») путем измерения поглощения света при длинах волн 280 нм, 260 нм и 230 нм и расчета соотношений А260/280 и А260/230. Целостность РНК проверяли электрофорезом образцов в 3 % агарозном геле с последующей визуализацией с помощью системы Gel Docтм XR+ («Bio-Rad Laboratories, Inc.»). Выделенную РНК хранили до следующего этапа эксперимента при температуре -70 °C.

На основе выделенной РНК посредством обратной транскрипции был проведен синтез одноцепочечной кДНК согласно протоколу коммерческого набора «High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit» («Applied Biosystems») на термоциклере «Veriti» («Applied Biosystems»). Концентрация и качество синтезированной кДНК также оценивали с помощью спектрофотометра «NanoDrop 2000» («Thermo Scientific») по аналогии с РНК. Синтезированная кДНК хранилась при температуре -20 °C.

Экспрессию генов, кодирующих изучаемые цитокины (IL1B, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL23, TNF, IFNG), оценивали методом количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) с детекцией результата в режиме реального времени с флуоресцентным красителем «SYBR Green» на амплификаторе «ViiA 7» («Applied Biosystems»). Праймеры были разработаны с использованием баз данных для поиска праймеров «PrimerBank» и «RTPrimerDB» и мануального скрининга в Google с последующей проверкой их качества в программах «PRaTo» и «PCR Primer Stats» [7, 9, 12, 14]. Праймеры были синтезированы ЗАО «Евроген» (Москва).

Для проведения кПЦР готовили реакционную смесь общим объемом 10 мкл, содержавшую 5 мкл мастер-микса «PowerUpтм SYBR® Green Master Mix» («Applied Biosystems»), по 500 нМ прямого и обратного праймеров и 10 нг кДНК. ПЦР проводили в стандартном 96-луночном оптическом планшете, содержащем, помимо 26 анализируемых образцов, 5 стандартов с двукратным разведением и отрицательный контроль (реакционная смесь, не содержащая кДНК). На каждый тестируемый образец, стандарт и отрицательный контроль готовили по три технические репликаты. Амплификацию осуществляли в течение 45 циклов по следующей схеме: денатурация — 15 с при 95 °C, отжиг — 15 с при 52–56 °C, элонгация — 1 мин при 72 °C с последующей проверкой специфичности реакции посредством построения и анализа кривых плавления. Нормализацию результатов ПЦР проводили с помощью трех референтных генов (генов «домашнего хозяйства») ACTB, GAPDH и B2M в соответствии с общепринятыми на настоящий момент рекомендациями [5]. Для оценки эффективности ПЦР анализировали графики амплификации и стандартные кривые в программе «QuantStudioтм Real-Time PCR Software v. 1.3» («Applied Biosystems»).

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных выполняли при помощи программ «GraphPad Prism 6» («GraphPad Software»). Межгрупповое сравнение измеренных уровней цитокинов проводили посредством однофакторного дисперсионного анализа. В случае выявления статистически значимых различий между группами осуществляли последующее попарное сравнение групп с использованием критерия Тьюки.Экспрессию изучаемых генов рассчитывали по методу Pfaffl и выражали на логарифмической (log10) шкале в виде кратного изменения относительно контрольных культур эндотелиальных клеток [10]. Различия между группами признавали статистически значимыми при вероятности отвергнуть верную нулевую гипотезу р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2019 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2019 Цитокины и Воспаление