Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2018 год
1-4 номера

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2018, №№ 1-4

Подписаться на 2019 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 1-4'2018

Изучение особенностей продукции цитокинов и функций нейтрофилов в очаге воспаления при хроническом гнойном риносинусите

Е.А. Варюшина, А.Ю. Котов, Н.В. Пигарева, С.А. Синева, А.В. Демьянов, Е.Н. Минаева, Л.Э. Тимчук, А.С. Симбирцев

Риносинуситы являются распространенным заболеванием верхних дыхательных путей, от 5 до 15% населения страдает разными формами этого заболевания. Патогенетические и иммунологические особенности течения воспалительного процесса при хроническом гнойном риносинусите (ХГРС) остаются недостаточно изученными. Целью работы стало изучение продукции цитокинов и функций нейтрофилов в очаге воспаления и периферической крови при ХГРС. Группы составили 70 пациентов с ХГРС и 48 здоровых добровольцев. Изучали продукцию цитокинов IL-1β, IL-2 и IL-8 клетками периферической крови, концентрации IL-1β и IL-8 в супернатантах измеряли методом ИФА, а IL-2 — в биологическом тесте на клетках CTLL-2. Уровни IL-1β, IL-8 и IL-6 в сыворотках крови и содержимом верхнечелюстных пазух измеряли методом ИФА. Проводили цитологический анализ содержимого пазух на мазках, окрашенных по Романовскому — Гимза. Оценивали фагоцитарную функцию нейтрофилов, полученных из пазух, в тесте с опсонизированными дрожжами. Результаты показали, что при ХГРС наблюдается значительное снижение индуцированной продукции IL-1β и IL-2, а также увеличение индуцированной продукции IL-8 клетками крови по сравнению с нормой (p<0,01). В содержимом пазух пациентов с ХГРС определялись высокие уровни IL-1β, IL-6 и IL-8, концентрации цитокинов превышали уровни данных медиаторов в сыворотках крови у тех же пациентов (p<0,01). В формуле крови при ХГРС отмечалось увеличение палочкоядерных и юных форм нейтрофилов. Цитологический состав содержимого пазух характеризовался преобладанием нейтрофилов (более 84%), макрофаги, лимфоциты, эозинофилы и клетки эпителия наблюдались в небольшом количестве. Показатели фагоцитоза нейтрофилов из очага воспаления были снижены по сравнению с показателями в крови тех же самых пациентов. Таким образом, при ХГРС происходят изменения продукции цитокинов и функциональной активности нейтрофилов, при этом нарушения в наибольшей степени выражены в очаге воспаления. (Цитокины и воспаление. 2018. Т. 17. № 1–4. С. 102–107.)

Риносинуситы являются распространенным заболеванием верхних дыхательных путей, разными формами этого заболевания страдает примерно 5–15% населения. Причинами развития хронического риносинусита (ХРС) могут быть генетическая предрасположенность, особенности строения носовой перегородки, системное и аллергическое воспаление или инфекции [6]. Несмотря на распространенность ХРС и большой интерес исследователей, патогенетические и иммунологические особенности течения воспалительного процесса при этом заболевании остаются недостаточно изученными. Хронический гнойный риносинусит (ХГРС) характеризуется длительным течением воспалительного процесса, а цитокины IL-1, IL-6, IL-8 являются основными медиаторами воспалительных процессов. IL-1β — это ключевой цитокин, который регулирует процессы воспаления на системном и местном уровне, а также восстановление поврежденных тканей за счет индукции факторов роста [3]. IL-2 стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов, продукцию ими IL-2 и усиливает цитотоксические свойства Т-клеток, пролиферацию и синтез антител В-клетками, противоопухолевую активность в NK клетках. IL-2 усиливает продукцию цитокинов моноцитами и фагоцитарную функцию этих клеток [3]. Важными биологическими функциями IL-6 при ХГРС могут быть провоспалительные эффекты за счет стимуляции экспрессии адгезионных молекул на эндотелии и хемотаксиса лейкоцитов, активации острофазового ответа [9]. В последнее время больше внимания уделяется исследованиям роли нейтрофильных гранулоцитов при различных формах риносинуситов [7]. IL-8 действует как основной хемоаттрактант для нейтрофилов, тем самым внося вклад в развитие воспалительного ответа [7]. В литературе есть данные, говорящие в пользу важной роли цитокинов в крови или в пазухах носа при риносинуситах, однако результаты остаются неполными и даже противоречивыми [11, 13]. В связи с этим целью нашего исследования стало изучение особенностей продукции цитокинов и функций нейтрофилов в очаге воспаления и периферической крови при ХГРС.

Материалы и методы

Исследования проведены у 70 пациентов с ХГРС и 48 здоровых добровольцев соответствующего возраста (норма). Обследование пациентов с ХГРС и получение материала для исследований проводили в ФГБУ «СПб НИИ ЛОР» Минздрава России, Санкт-Петербург. Длительность заболевания составляла 5–10 лет, пациенты находились в стадии обострения ХГРС. Для постановки диагноза были использованы клинико-лабораторные методы и компьютерная томография (КТ). Больные с гнойно-полипозными формами ХГРС были исключены из данного исследования. У пациентов получали венозную кровь и содержимое верхнечелюстных пазух. Пункции верхнечелюстных пазух выполняли по стандартным методикам, перед этим проводили предварительное активное очищение пазух в течение 2–5 дней. У добровольцев получали для исследований венозную кровь.

Кровь собирали в пробирки-вакутейнеры, содержащие гепарин («Beckton Dickinson», США). Проводили выделение клеток по стандартной методике (Boyum A, 1968). Для получения нейтрофилов эритроциты лизировали дистиллированной водой, после этого лейкоциты дважды отмывали физиологическим раствором (ФР) с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 400 g. Жизнеспособность клеток в тесте с окрашиванием трипановым синим составляла не менее 95 %. Для получения сыворотки 4 мл венозной крови отбирали в сухую чистую пробирку, сгусток обводили стеклянной палочкой, центрифугировали 10 мин при 400 g, затем у переносили в чистую пробирку и хранили при -20 °С.

Для индукции продукции цитокинов 0,6 мл цельной крови разводили в 2,4 мл среды RPMI 1640 с добавлением 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина. Рабочий раствор индуктора готовили так, чтобы в 100 мкл среды содержалось 1,0 мкг продигиозана. Для индукции IL-8 использовали рекомбинантный IL-1b человека (ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России) в концентрации 20,0 нг/мл в среде PRMI 1640. В 96-луночный планшет («COSTAR», Франция) вносили индукторы (индуцированная продукция) или среду без индукторов (спонтанная продукция) по 100 мкл на лунку, затем во все лунки добавляли по 100 мкл разведенной крови. Культивирование проводили в СО2 -инкубаторе при 37 °С и 5 % СО2 в течение суток, после чего осторожно отбирали супернатанты в новые планшеты и хранили при -20 °С.

Уровни цитокинов в биологических жидкостях определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для определения IL-1β и IL-8 использовали тест-системы производства ООО «Цитокин» (Россия), IL-6 — производства фирмы «R&D systems» (США). Определение проводили по стандартным методикам в соответствии с рекомендациями фирм-производителей. Результаты реакции учитывали при длине волны 450 нм (для IL-1β и IL-8) или 495 нм (для IL-6) на спектрофотометре для планшетов модели 3550 («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Концентрацию цитокинов в образцах определяли по калибровочной кривой соотношения оптической плотности раствора в лунке и известных концентраций данного цитокина, использованного как стандарт, умножая на соответствующее разведение образца. Частоту выявления цитокинов высчитывали в процентах как отношение количества пациентов, у которых определялся данный цитокин к общему числу обследованных.

Для индукции IL-2 образцы крови инкубировали с 50 мкг/мл ФГА («Sigma», США) или без индуктора в СО2-инкубаторе 24 ч, супернатанты отбирали и хранили при -20 °С. Активность IL-2 в супернатантах определяли в биологическом тесте с помощью IL-2-зависимой линии CTLL-2, как описано ранее [5]. В качестве контроля использовали рекомбинантный IL-2 человека («Sigma», США). Через 48 ч добавляли 3Н-тимидин (5 мкКюи/мл) («Изотоп», Россия), и еще через 20 ч переносили клетки на фильтры с помощью полуавтоматического харвестера («TITERTEK», «Flow Laboratories», США). Содержание радиоактивной метки определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике («Rackbeta 1217», «Wallac», Финляндия). Концентрации IL-2 в супернатантах определяли по калибровочной кривой, построенной по стандарту IL-2.

Для подсчета количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы крови кровь собирали в пробирки-вакутейнеры с ЭДТА («Beckton Dickinson», США). Подсчет проводили с помощью гематологического анализатора («Beckman Coulter», США), а также подсчитывали морфологический состав крови в мазках, окрашенных по Романовскому — Гимза («Биовитрум», Россия), используя световой микроскоп DMLB («Leica Microsystems AG», Германия).

Содержимое верхнечелюстных пазух центрифугировали в пробирках 10 мин при 400 g. Образцы надосадочной жидкости использовали для определения содержания цитокинов при необходимости хранили при -20 °С. Клетки дважды отмывали ФР с последующим центрифугированием 10 мин при 400 g. Жизнеспособность нейтрофилов, полученных таким образом, в тесте с трипановым синим составляла 76,1±3,56 %. Из клеточной взвеси содержимого пазух изготавливали мазки на предметных стеклах, высушивали, фиксировали в этаноле 10 мин и окрашивали по Романовскому — Гимза. Стекла изучали под световым микроскопом с использованием масляной иммерсии, подсчитывали 200 клеток на каждом препарате.

Фагоцитарную функцию нейтрофилов оценивали в тесте с использованием опсонизированных дрожжей в качестве объекта фагоцитоза. Нейтрофилы ресуспендировали в среде RPMI 1640 с 10 % FCS в концентрации 2,0×106 кл./мл, вносили суспензию дрожжей так, чтобы соотношение нейтрофилы/дрожжевые клетки равнялось 1:10. Пробы инкубировали 40 мин при 37°С на шейкере, клетки осаждали центрифугированием 10 мин при 400 g. Из осадка готовили мазки, сушили на воздухе, фиксировали этанолом 10 мин, а затем окрашивали по Романовскому — Гимза. Результаты реакции учитывали под световым микроскопом с использованием масляной иммерсии. Подсчитывали фагоцитарный индекс (процент нейтрофилов, вступивших в фагоцитоз) и фагоцитарное число (среднее количество дрожжевых клеток, поглощенное одним нейтрофилом, выражали в условных единицах, у. е.).

Статистический анализ проводили с помощью программы «Microsoft Excel-2007» («Microsoft Corporation»). Подсчитывали среднее значение и ошибку среднего (M ± m). Различия между группами оценивали с использованием t-теста Стьюдента для независимых переменных, для сравнения парных показателей использовали парный t-тест Стьюдента. Различия считались достоверными при вероятности не менее 95% (р<0,05).

Результаты и обсуждение

Ключевые слова: хронический гнойный риносинусит, цитокины, фагоцитоз, нейтрофилы.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2019 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2019 Цитокины и Воспаление