Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: www.cytokines.ru


  


2018 год
1-4 номера

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2018, №№ 1-4

Подписаться на 2019 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

Краткие сообщения

Номер 1-4'2018

Исследование методом нелинейного магнитного отклика и магнитно-резонансной томографии биораспределения магнитных наночастиц в животных моделях глиальных опухолей человека

Я.Ю. Марченко, Л.Ю. Яковлева, О.В. Злобина, А.М. Ищенко, Б.П. Николаев, М.А. Шевцов, В.А. Рыжов

Исследовано биораспределение конъюгата белка теплового шока БТШ70, конъюгированного с магнитными наночастицами (МНЧ) оксида железа МНЧ-К-БТШ70 в модели глиомы 9L у крыс. Измерения проводили оценкой продольного нелинейного отклика (ПНЛ-М2) на слабое переменное магнитное поле, в котором регистрируется вторая гармоника намагниченности M2 в зависимости от значения поля сканирования. Показано, что конъюгаты МНЧ-К-БТШ70 в органах крыс находятся в суперпарамагнитном состоянии. Относительное содержание МНЧ в опухоли головного мозга по сравнению с нормальной мозговой тканью и тканями других органов коррелирует с данными контрастирующей эффективности наночастиц в методе магнитно-резонансной томографии (МРТ). (Цитокины и воспаление. 2018. Т. 17. № 1–4. С. 108–113.)

Ключевые слова: глиома, белок теплового шока, МРТ, Hsp70, магнитные наночастицы.

Магнитные наночастицы (МНЧ) оксида железа в сочетании с техникой магнитно-резонансной томографии (МРТ) составляют основу нового терапевтического подхода в нейро-онкологии [16]. Благодаря уникальным физическим свойствам, МНЧ обладают большим потенциалом для диагностики и терапии злокачественных опухолей головного мозга, если их конъюгировать с адресными биолигандами рецепторного узнавания [5]. В качестве биолиганда для модификации поверхности МНЧ может быть использован белок теплового шока массой 70 кДа (БТШ70), способный узнавать глиальные клетки благодаря высокой экспрессии CD40 на их мембранах [13]. Известно, что применение МНЧ для тераностики нуждается в оценке риска накопления наночастиц внутри органов и токсических эффектов. Накопление тканью наночастиц может вызывать воспалительный ответ [9]. Функционализация частиц дополнительно влияет на их распределение в организме и может приводить к нежелательному накоплению МНЧ-К-БТШ70 в CD40-экспрессирующих тканях, включая ретикулоэндотелиальную систему, гладкомышечные клетки, фибробласты, гепатоциты [4]. Основной причиной токсичности, создаваемой МНЧ, является окислительный стресс. Реакционноспособные формы кислорода (РФК) могут быть образованы по нескольким механизмам, которые включают образование РФК на поверхности наночастиц, выщелачивание ионов металлов из ядра оксида железа, выделение окислителей ферментативной деградацией магнитных конъюгатов. Окислительный стресс может привести к деградации частиц с последующим уменьшением их размеров, магнитного момента и тем самым к снижению контрастирующей эффективности наночастиц в МРТ. После внутриклеточного включения МНЧ появляются в лизосомах и превращаются в растворимую парамагнитную форму железа, которая становится частью обычного пула железа (например, ферритина, гемоглобина) [1, 6]. Сохранение контрастирующей эффективности МНЧ определяется скоростью этих процессов.

В данной работе биораспределение МНЧ-К-БТШ70 в модели глиомы 9L у крыс проводили измерением продольного нелинейного отклика (ПНЛ-М2) на слабое переменное магнитное поле, когда регистрируется вторая гармоника намагниченности M2 в зависимости от значения сканируемого постоянного поля H, параллельного переменному полю [3, 10, 11]. Измерения проводили на оригинальной установке, адаптированной для измерения МНЧ [3]. Магнитное состояние конъюгатов МНЧ-К-БТШ70 в органах крыс, близкое суперпарамагнитному, облегчает их дифференциацию от других парамагнитных форм. Метод ПНЛ-М2 позволяет оценивать по амплитуде M2(H) относительное содержание МНЧ в опухоли головного мозга по сравнению с нормальной мозговой тканью и тканями других органов и сравнивать с контрастирующей эффективностью наночастиц в МРТ. Оценку магнитно-резонансного (МР) контраста 9L глиомы частицами МНЧ-К-БТШ70 проводили с помощью высокопольного МР-сканера (11Т).

Материалы и методы

Клетки глиосаркомы 9L

Линия клеток глиосаркомы 9L получена из Российской коллекции клеточной культуры в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). 9L выращивали в CO2-инкубаторе (37 °C, 6 % CO2) в среде DMEM, дополненной 10 % фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками (100 ЕД/мл пенициллина G и 0,1 мг/мл стрептомицина).

Ортотопическая модель опухоли головного мозга

Самцы крыс Wistar весом 280–300 г были приобретены в питомнике животных (Российская академия медицинских наук (РАМН) «Рапполово», Санкт-Петербург, Россия). После внутрибрюшинной анестезии с 10 мг «Zoletyl-100» (тилетамин гидрохлорид и золазепам, «Virbac santé Animale», Франция) и 0,2 мл 2 % «Rometar» (ксилазин гидрохлорид, «Bioveta», Чехия) крысы были установлены в стереотаксическую рамку («David Kopf Instruments», Туджунда, Калифорния). Клетки глиомы 9L (1 × 106 клеток/мл), ресуспендированные в 10 мкл фосфатно-буферного раствора (PBS), стереотаксически вводили в nucl. caudatus dexter. Все эксперименты на животных были одобрены местным этическим комитетом ФНБУН «Институт цитологии РАН» (Санкт-Петербург, Россия).

Синтез магнитных конъюгатов с БТШ70

Рекомбинантный белок теплового шока 70 кДа (БТШ70) получен методом генной инженерии с последующей очисткой методами анионообменной и АТФ-аффинной хроматографии на ATP-Agarose («Sigma-Aldrich», США) как описано авторами [2].

МНЧ получали из растворов солей железа путем совместного осаждения в щелочной среде при 80 °С, по Massart’у [7]. FeSO4 и FeCl3 при отношении Fe2+/ Fe3+ 1:2 растворяли в воде с добавлением CsCl. Осаждение магнетита индуцировали раствором NH4OH в инертной атмосфере N2. Для стабилизации дисперсии МНЧ в процессе ультразвуковой обработки 22 кГц добавляли низкомолекулярный декстран (ММ 10 кД, «Sigma-Aldrich», США). Готовую суспензию МНЧ промывали и разделяли на фракции путем центрифугирования и микрофильтрации на мембранах с порами 0,2 мкм («Millipore», США). Содержание Fe в суспензии контролировали УФ-поглощением комплекса тиоцианат-Fe3+ при λ=480 нм. Для конъюгации с БТШ70 декстрановое покрытие магнитных наночастиц было «прошито» эпихлоргидрином и аминировано. Конъюгацию проводили по карбоксильным группам БТШ70, которые предварительно активировали водорастворимым карбодиимидом. Содержание Fe в образцах магнитных конъюгатов анализировали с помощью спектрофотометрии комплекса тиоцианат-Fe3+, полученного растворением в HNO3. Содержание БТШ70 в образцах конъюгата измеряли иммуноферментным анализом с помощью кита человеческих БТШ70 (ООО «Протеиновый Контур», Санкт-Петербург). Размер частиц и распределение по размерам МНЧ и их конъюгатов изучали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с использованием микроскопа «JEOL-2000EX» (Япония) и динамического светорассеяния (ДРС) с использованием «Zetasizer Nano» («Malvern Instruments»). Спектры ЯМР и времена магнитной релаксации, т. е. T1, T2 и T2*, были измерены с использованием ЯМР-спектрометра «CXP-300» («Bruker», Германия) с магнитным полем 7,1 Tл. Для оценки времени магнитной релаксации применялись импульсные последовательности инверсия-восстановление и Карра —Пёрселла — Мейбума — Гилла (CPMG). Время релаксации протонов изучали как функцию концентрации конъюгата МНЧ-К-БТШ70 в буферном растворе. Коэффициенты релаксационной эффективности, т. е. r1, r2 и r2*, определяли по тангенсам углов наклона концентрационных графиков.

Анализ взаимодействия конъюгатов МНЧ-К-БТШ70 с клетками глиомы 9L

Наночастицы МНЧ-К-БТШ70 добавляли к культуре клеток глиомы 9L в течение 1, 6, 12 и 24 ч. Концентрация Fe3+ варьировала от 100 до 350 мкг/мл. После инкубации клетки глиомы интенсивно промывали от непоглощенных частиц фосфатным буферным раствором, фиксировали 4 %-ным формальдегидом и анализировали с помощью конфокальной микроскопии на микроскопе «Leica TCS SP5» («Leica Microsystems», Германия) на 488 нм. Для оценки возможного CD40-опосредованного поглощения конъюгатов МНЧ-К-БТШ70 в 9L-клетки последние до добавления наночастиц инкубировали с анти-CD40 антителами («BD Biosciences») или изотипическими IgG1-антителами («BD Biosciences»). Кроме того, частицы МНЧ-К-БТШ70 при добавлении к клеточной среде инкубировали с моноклональными антителами cmHsp70.1 в течение 1 ч. Жизнеспособность клеток анализировали с помощью 4 %-го исключения трипанового синего и теста МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия). Клетки, инкубированные с PBS, использовали в качестве контрольных клеток. Включение наночастиц далее оценивали с помощью ПЭМ. 9L, совпадающие с неконъюгированными МНЧ или МНЧ-К-БТШ70 в течение 24 ч, фиксировали в 2,5 % глутаральдегиде в 0,1 М какодилатном буфере, встроенном в Epon и Araldit, и разделяли на ультракороткой LKB. Ультратонкие срезы были исследованы с помощью электронного микроскопа «Zeiss Libra 120» («Carl Zeiss Group», Германия). Для анализа внутриклеточной локализации включенных участков Hsp70-конъюгатов клетки окрашивали моноклональными антителами против EEA-1 («Abcam», США) и анти-CD40 антителами («BD Biosciences»).

Исследование биораспределения МНЧ-БТШ70 конъюгата методом ПНЛ-М2

Для оценки распределения наночастиц по органам животные через 20 дней после инокуляции клеток глиомы были случайным образом распределены по трем группам (по 3 животных): 1-я — контрольная группа; 2-я — обработанные МНЧ (Fe3+ при 2,5 мг/кг) и 3-я группа МНЧ-К-БТШ70 (Fe3+ при 2,5 мг/кг). Через 24 ч животных умерщвляли и получали образцы органов для магнитных измерений (по 3 образца по 100 мг на каждый орган), включая нормальный мозг, глиому 9L, легкие, сердце, почку, печень, селезенку, мышцы и кожу. Содержание МНЧ в суперпарамагнитном состоянии в тканях оценивали регистрацией нелинейного продольного отклика на слабое переменное магнитное поле h(t) = h sin (ωt) (где частота f = ω/2π = 15,7 МГц и h = 13,8 Э) в параллельном ему постоянном поле H на специально сконструированной установке. В состав установки входит электромагнит, объединенный с двумя катушками Гельмгольца для линейного сканирования постоянного поля H с частотой в диапазоне от 10-2 Гц до 8 Гц и высокочастотной индуктивной катушкой, обеспечивающей регистрацию сигнала M2. Принцип метода заключается в регистрации нелинейного отклика намагниченности на второй гармонике, как показано на рис. 1. Регистрируется наибольшая из четных гармоник намагниченности образца, другие гармоники (включая основную частоту 15,7 МГц) подавляются согласованными радиочастотными фильтрами. Реальная ReM2(H) и сдвинутая по фазе 90° ImM2(H) компоненты сигнала M2, записываются синхронно с H-сканированием, что позволяет получить информацию о магнитных параметрах с высокой чувствительностью 10-10 СГСМ.

Томографические исследования проводили на МР-сканере 11 Тл («Bruker», Германия) в режимах RARE-T1, TurboRARE-T2, FLASH и MSME.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2019 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2019 Цитокины и Воспаление