Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: cytokines.ru


  


2017 год
3 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

https://pornoseksxxx.com/

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2003, № 3

Подписаться на 2018 год

Заказать эту статью в PDF

Врачу общей практики

Номер 3'2003

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ УРОВНЕЙ ЦИТОКИНОВ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

А.В. Демьянов, А.Ю. Котов, А.С. Симбирцев

В последние годы, благодаря развитию методов количественного определения уровней продукции цитокинов, был достигнут значительный прогресс в понимании роли некоторых цитокинов в норме и при патологии. Наиболее оптимальными для оценки уровней цитокинов являются иммуноферментные методы, которые высокоспецифичны, просты и быстры в исполнении. Применение диагностических иммуноферментных тест-систем для оценки цитокинового статуса, как на местном, так и на системном уровнях при различных патологиях является существенным дополнением к пониманию патогенеза заболеваний. В статье представлен обзор применения иммуноферментных тест-систем для определения уровней некоторых цитокинов: интерлейкина 1a (IL-1a), интерлейкина 1b (IL-1b), антагониста рецептора IL-1a (IL-1Ra), интерлейкина 4 (IL-4), интерлейкина 8 (IL-8), фактора некроза опухолей альфа (TNFa), интерферона a (IFNa) и интерферона g (IFNg) в биологических жидкостях у здоровых людей и пациентов с различной патологией. Изучение уровней цитокинов позволяет получить информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток; о тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и прогнозе, о соотношении процессов активации Т-хелперов 1 и 2-типов, о стадии развития ряда аллергических и аутоиммунных заболеваний. Оценка уровней цитокинов, в частности, с использованием иммуноферментных диагностических тест-систем позволяет по-новому подойти к изучению состояния иммунной системы организма в клинической практике. (Цитокины и воспаление, 2003, Т. 2, № 3, с. 20-35)

Ключевые слова: цитокины, иммуноферментные тест-системы.

Введение

"Для чего необходимо изучать уровни цитокинов?" - самый частый вопрос, который задают лечащие врачи, впервые увидев концентрацию IL-8 в бланке развернутого иммунологического обследования. Неоднозначность трактовки результатов у пациентов с разными заболеваниями является основной причиной, почему врачи игнорируют подобные исследования. До настоящего времени диагностическая ценность подобных анализов не определена в полной мере. Однако в последние годы, благодаря развитию методов количественного определения уровней продукции цитокинов, был достигнут значительный прогресс в понимании роли некоторых цитокинов в норме и при патологии. Наиболее оптимальными являются иммуноферментные методы, которые высокоспецифичны, просты и быстры в исполнении. Применение диагностических иммуноферментных тест-систем для оценки цитокинового статуса как на местном, так и на системном уровнях при различных патологиях является существенным дополнением к пониманию патогенеза заболеваний. Кроме того, они используются при применении новых иммуномодулирующих препаратов на основе рекомбинантных цитокинов и их антагонистов для изучения фармакокинетики этих препаратов, а также их способности индуцировать синтез других цитокинов.

Измерение уровней цитокинов

Количественно измерить уровень цитокинов можно двумя основными группами методов: биологическими и иммунохимическими.

Биологические методы относятся к наиболее чувствительным и с биологической точки зрения представляются более "правильными", поскольку определяют только активные формы цитокинов и могут более адекватно отражать работу системы цитокинов in vivo. Клетками-мишенями для биологических методов являются либо клеточные линии (СТLL-2 - IL-2-зависимая клеточная линия, В9 - IL-6-зависимая клеточная линия, D10S - IL-1-зависимая клеточная линия и др.), либо первичные культуры клеток гемопоэтической/иммунной системы.

Уровень цитокинов в образцах оценивается в основном по их способности стимулировать или ингибировать пролиферацию либо дифференцировку клеток. Кроме измерения пролиферативной активности, для оценки уровня таких цитокинов, как TNFa и TNFb, используются методы, основанные на цитотоксической активности данных цитокинов по отношению к некоторым клеточным линиям. Для оценки интерферонового статуса используются методы, основанные на антивирусной активности интерферонов. При этом используются различные клетки-мишени, зараженные вирусом, на которых оценивается антивирусная активность интерферонов с помощью витальных красителей.

Однако биологические методы имеют и ряд существенных недостатков: 1 - они являются более трудоемкими и сложными в исполнении, 2 - требуют значительно больше времени до получения конечного результата, 3 - требуют особых стерильных условий для постановки, 4 - являются менее специфичными, чем иммунологические методы. Несомненно, последнее свойство является главным недостатком биологических методов оценки уровня цитокинов. Так, широко используемая IL-2-зависимая линия клеток СТLL-2, кроме IL-2, может реагировать повышением пролиферации и на IL-15; IL-1-зависимая линия клеток D10S может реагировать также и на IL-2; IL-6-зависимая мышиная гибридома В9 отвечает также и на IL-11, IL-13 [26]. Учитывая все эти доводы, можно заключить, что иммунохимические методы для оценки уровня цитокинов являются более предпочтительными.

Иммунохимические методы

В настоящее время для определения уровня цитокинов в различных биологических жидкостях применяются разнообразные твердофазные иммуноферментные методы, получившие наиболее широкое распространение. В данных системах используются наборы из нескольких антител. В качестве первых антител используются моноклональные антитела (мАТ), которые сорбируются на 96-луночных планшетах и обладают способностью захватывать антиген (в данном случае - цитокин) из раствора. В качестве вторых антител используются биотинилированные поликлональные антитела (пАТ), которые "открываются" стрептавидин-фермент-субстратным комплексом. Возможно также использование наборов из трех антител, когда вторые поликлональные антитела "открываются" антивидовыми антителами, конъюгированными с ферментом. В результате образуется "сэндвич" из двух или трех антител и молекулы антигена между ними. Количественную оценку результатов проводят, сравнивая результаты с кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного антигена (рис. 1). Для расчета используется линейный участок стандартной кривой.

Иммуноферментные методы высокоспецифичны, быстры (время постановки иммуноферментного анализа составляет менее 5 ч) и относительно просты в исполнении. Порог чувствительности для таких тест-систем достигает 0,5 пкг/мл.

В настоящее время общедоступны коммерческие варианты иммуноферментных систем для определения широкого спектра цитокинов. В России существуют лишь единичные варианты подобного рода тест-систем. В данной статье представлен обзор применения тест-систем производства ООО "Цитокин" (Санкт-Петербург) для определения уровня цитокинов (IL-1a, IL-1b, IL-1Rа, IL-4, IL-8, TNFa, IFNa, IFNg и G-CSF) в биологических жидкостях. Данные тест-системы представляют собой "сэндвич"-метод с использованием пары моноклональных антител (мАТ) либо мАТ и поликлональных АТ (пАТ). Все тест-системы были получены c использованием стандартных методик получения антител.

Для получения моноклональных антител спленоциты мыши, иммунизированной рекомбинантным антигеном цитокина, сливали с клеточной линией мышиной миеломы Sp2/0Ag14, в результате чего появлялась гибридома. После многократного реклонирования и скрининга отбирали клоны, продуцирующие большое количество высокоспецифичных мАТ. Для массовой продукции мАТ гибридомный клон прививали в брюшную полость сингенной мыши для получения асцитной опухоли. Через 2-3 нед. после инъекции клеток собирали асцитическую жидкость, в которой содержатся мАТ в большой концентрации. Очистку мАТ проводили методом иммуноаффинной хроматографии. В качестве сорбента использовали сефарозу 4В (Pharmacia) с иммобилизованным цитокином.

Для получения поликлональных антител кроликов иммунизировали антигеном внутрикожно. После второй иммунизации производили забор крови из ушной вены для определения титра антител. Иммунизацию кролика продолжали до достижения необходимого титра антител (" 1:10000) в сыворотке крови, после чего на 10-й день от последней иммунизации у кролика брали кровь и получали сыворотку, из которой затем методом иммуноаффинной хроматографии выделяли пАТ.

Определение уровней цитокинов в различных биологических средах

Большинство ИФ тест-систем адаптированы для работы с различными биологическими жидкостями. Для измерения уровней цитокинов на системном уровне используют сыворотку или плазму крови. Несмотря на короткий (минуты) период жизни цитокинов [51], в сыворотках даже здоровых доноров иногда определяются низкие уровни цитокинов. Обычно они находятся за порогом чувствительности иммуноферментного метода [71]; но при различных заболеваниях, связанных с острой или хронической продукцией цитокинов, их сывороточные уровни становятся значительно выше. Однако, поскольку цитокины являются локальными медиаторами, более целесообразно измерять их уровни в соответствующих тканях после экстракции тканевых протеинов или в естественных жидкостях например, в слезе, жидкости десневых карманов [3], смывах из полостей, моче, спинномозговой жидкости и даже в конденсате выдыхаемого воздуха [10].

Определение продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови (МПК) как при стимуляции in vitro, так и без нее, является альтернативой определения уровня цитокинов в плазме крови. Хотя известно, что цитокины продуцируются различными типами клеток, МПК служат в качестве удобной модели для оценки продукции цитокинов в основном из-за их доступности. Причем определение уровней продукции различных цитокинов in vitro может проводиться с использованием цельной крови, что значительно упрощает процедуру постановки теста. При активации in vitro такими агентами, как фиторемагглютинин или бактериальный липополисахарид, МПК секретируют в культуральную среду целый спектр провоспалительных цитокинов: IL-1, IL-6, IL-8, TNFa и др. Определение уровня цитокинов в супернатантах МПК позволяет избежать ряда сложностей, описанных при определении цитокинов в сыворотке или плазме, и обеспечивает надежную оценку способности клеток продуцировать цитокины.

В целом, можно сказать, что уровни цитокинов в плазме крови отражают текущее состояние работы иммунной системы и развития защитных реакций, т.е. синтез цитокинов клетками организма in vivo. Определение уровней продукции цитокинов изолированными клетками in vitro показывает функциональное состояние клеток. Спонтанная продукция цитокинов МПК в культуре свидетельствует о том, что клетки уже активированы in vivo либо в результате методических манипуляций с клетками in vitro [71]. Индуцированная продукция цитокинов позволяет оценить потенциальные возможности активации клеток, что очень важно для оценки иммунологической реактивности. Сниженная индуцированная продукция цитокинов in vitro может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Поэтому оба варианта изучения уровней цитокинов в циркуляции либо продукции лейкоцитами важны с точки зрения характеристики работы иммунной системы.

Если Вы хотите прочесть статью целиком, заказывайте компакт-диск,
на котором Вы найдете ВСЕ статьи ВСЕХ номеров журнала за 2002 и 2003 годы!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2018 Цитокины и Воспаление