197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2005, № 3

ГЕНОДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ: КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ПОДХОДЫ

М.Н. Болдырева

Полимеразная цепная реакция - метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить несколько специфических молекул ДНК в присутствии миллионов других молекул.

Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия.

В 1983 г. сотрудник фирмы "Cetus" K. Mullis предложил метод, ставший в дальнейшем известным как "полимеразная цепная реакция". Суть метода заключалась в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом последующем цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь и вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ.

Следует отметить, что созданию нового метода способствовало развитие некоторых технологий, в частности появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды). В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментативная система, в частности ДНК-полимераза, выдерживает высокие температуры горячих источников и сохраняет свою биологическую активность вплоть до 95 °С, что является необходимым условием для проведения полимеразной цепной реакции.

Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. В 1985 г. Saaki et al. опубликовали статью, в которой была описана амплификация участка гена бета-глобина. С этого момента количество публикаций, в которых авторы сообщали о применении ПЦР в своих работах, стало увеличиваться в геометрической прогрессии. Бурный рост информационных баз данных (содержащих последовательности ДНК различных биологических объектов), возможный благодаря современным методам секвенирования, а также их доступность способствовали созданию самых разных тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций и т. д., то есть ПЦР перешла из сугубо научной в область практического применения.

"Классическая" ПЦР предполагает анализ результатов по окончании процесса амплификации при достижении реакцией "эффекта плато". В этом случае речь идет о качественной ПЦР. Анализ реакции можно проводить методами электрофореза или гибридизации. В результате анализа можно сказать только прошла реакция или нет.

Создание новых технологий, таких как FLASH (Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization), т. е. специфическая гибридизация в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флюорофорами, а также приборов, позволяющих измерять накопление флюоресценции в процессе полимеразной цепной реакции (т. н. "real-time"-машин), позволило перейти на качественно новый уровень - количественную ПЦР.

При количественном исследовании образцов каждая серия экспериментов сопровождается постановкой амплификации с контрольными образцами, в которой заведомо известно количество копий ДНК (калибровочные образцы). Сравнение кинетики накопления продуктов амплификации в экспериментальных и контрольных образцах позволяет оценить концентрацию ДНК в диапазоне разведений контрольных препаратов ДНК.

Таким образом, в настоящее время существуют и доступны, особенно после появления на рынке отечественного оборудования для real-time ПЦР - ДТ322 ("ДНК-Технология", Москва), два вида ПЦР-анализа - качественный и количественный.

Возникает вопрос, в каких случаях следует применять тот или иной вид анализа?

Качественную ПЦР можно использовать в следующих случаях:

• Диагностика инфекционных заболеваний, вызванных безусловными патогенами;
• Скрининг инфекционных агентов перед проведением количественной ПЦР;
• Диагностика онкологических заболеваний;
• Диагностика генетических заболеваний;
• Идентификация личности;
• Скрининг генетически модифицированных источников пищи.

Если Вы хотите прочесть статью целиком, заказывайте компакт-диск,
на котором Вы найдете ВСЕ статьи ВСЕХ номеров журнала за 2005 и 2006 годы!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.